草鱼点状产气单胞菌单克隆抗体的制备与双抗原夹心ELISA法的建立

为了建立一种快速、准确能早期检测草鱼肠炎病原菌的方法,以患病草鱼为材料,制备点状产气单胞菌单克隆抗体(McAb),并鉴定其特异性和抗原表位;采用过碘酸钠方法,以辣根过氧化物酶标记单抗,用试管凝集试验测定其活性;建立点状产气单胞菌McAb的双抗原夹心ELISA检测方法,确定包被单抗和酶标单抗的浓度,并测定其灵敏度和特异性。结果:1)获得了2株特异性强和抗原表位不同的单抗,其ELISA效价为1∶16 000。2)辣根过氧化物酶标记的抗体活性为1∶640。3)建立了包被抗体稀释度为1∶800、酶标抗体稀释度为1∶1 600的双抗原夹心ELISA检测方法,该方法与点状产气单胞菌呈强阳性反应,与近似菌无交叉反应,灵敏性为7×103cfu/mL。结论:制备的点状产气单胞菌McAb的效价高、特异性强;建立的双抗原夹心ELISA方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可应用于草鱼肠炎病原体的早期快速检测。     

罗非鱼无乳链球菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

通过杂交瘤技术制备抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白单克隆抗体2株:1C9和6G5,均为IgM,效价分别为10-5和10-4,间接ELISA结果显示单克隆抗体1C9对无乳链球菌具有良好的检测特异性和灵敏性;同时制备兔抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白多克隆抗体及其HRP酶标记物,兔抗SIP蛋白多克隆抗体的效价为10-6,经标记的抗体效价为10-4,最佳抗体工作浓度为1:400.建立双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测罗非鱼无乳链球菌的方法,具良好的特异性,检测灵敏度为0.85×106 CFU· mL-1.双抗体夹心ELISA检测实际应用结果与双重PCR检测比较,相对符合率为98.33％,检测结果可靠性高.     

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明：所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^-1,最佳线性范围为25～1 600 ng·mL     

多羟基双萘醛提取物对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用

【目的】探讨多羟基双萘醛提取物(WCT)对猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyingae pv.actinidiae)的抑制作用。【方法】采用平板抑菌圈法和猕猴桃苗盆栽接菌的方法,测定WCT对猕猴桃溃疡病菌生长的抑制作用,并在7年树龄的猕猴桃树上进行田间药效试验,分析WCT对猕猴桃苗各处理的多酚氧化酶(PPO)与过氧化氢酶(POD)活性及病程相关蛋白的诱导情况。【结果】WCT对猕猴桃溃疡病菌的抑制中浓度(EC50)为11.5 mg/mL;猕猴桃苗接种WCT和病原菌后,其PPO和POD活性均保持在较高的水平,其中WCT预防处理的PPO和POD活性均较其他处理高;SDS-PAGE电泳分析结果显示,WCT处理和接种猕猴桃溃疡病原菌均可诱导产生分子质量为35 ku的蛋白。【结论】WCT对猕猴桃溃疡病菌的生长有显著的抑制作用,通过在猕猴桃树上涂药可诱导寄主产生抗病性,进而减轻病害的发生。     

生物素——亲和素酶联免疫吸附测定法检测水稻白叶枯病病菌

在以单克隆杭体为第2抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)的基础上,应用生物素——亲和素系统,建立了亲和素——生物素化辣根过氧化物酶复合物——酶联免疫吸附测定法(ABC-ELISA)检测水稻白叶枯病病菌。比较了ABC-ELISA法和常规ELISA法的差异,表明ABC-ELISA法的灵敏度比常规ELISA法高10～100倍。常规ELISA双夹心法的检出量一般为10~6菌体/ml,ABC-ELISA双夹心法达10~菌体/ml;全菌包被ELISA间接法为10~5菌体/ml;而ABC-ELISA间接法为10~3个菌体/ml。ABC-ELISA法并不影响单克隆抗体的高度特异性。用ABC-ELISA法检测58份水稻白叶枯病病叶,16份病种,病叶全部表现阳性反应,病种稻壳如取样在1g以上,检出率较高。     

间接酶联免疫吸附法测定大鲵凝集素

[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1∶16 000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1∶3 000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1∶30 000,抗原浓度在31.25~1 000.00 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数R~20.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。     

甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体制备及初步检测

以纯化培养的甘蔗宿根矮化病(RSD)病菌作为抗原,免疫健康家兔,制备了RSD多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附试验检测其效价,并通过斑点酶标免疫法(Dot blot enzyme immunoassays,DB-EIA)确定其工作浓度,同时与澳大利亚的抗体比较。结果表明,制备的RSD多克隆抗体效价大于1∶10000,在用DB-EIA法检测样本时的工作浓度以稀释10倍较好;与澳大利亚抗体的检测结果一致,但在印迹着色方面比澳大利亚的浅一些。试验结果表明,自制RSD抗体的效价略低于澳大利亚RSD抗体,但检测效果较好,可以满足今后在甘蔗生产上对RSD的检测要求。     

新型固定化乙酰胆碱酯酶传感器的制备及氨基甲酸酯农残检测

以双醛纤维素(dialdehyde cellulose,DAC)为固载酶基质材料,通过固定化酶化学键联技术制备固定化乙酰胆碱酯酶(DAC-AChE),采用自组装法制备多层壳聚糖/固定化乙酰胆碱酯酶/功能化碳纳米管生物传感器(Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE),利用交流阻抗法(AC impedance,ACI),循环伏安法(cyclic voltammetry,CV)及差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)考察新型传感器对农残的检测性能。结果表明:成功制备了新型固定化乙酰胆碱酯酶电化学传感器;新型传感器对氨基甲酸酯杀虫剂1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯(carbary,CAB)具有良好的响应,检测方法响应快速,线性范围宽,灵敏度高,最低检出限可达3.5 μg·L-1,具有很好的重现性和稳定性,有关结果可为氨基甲酸酯类杀虫剂的检测提供一种新的分析方法。     

牛奶β-酪蛋白和大豆β-伴球蛋白双抗制备及夹心ELISA快速定性检测技术的建立

采用牛奶β-酪蛋白和大豆β-伴球蛋白分别免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)筛选制备单克隆抗体,同时分别制备兔抗β-酪蛋白和β-伴球蛋白多克隆抗体;通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA用于乳品掺假以及牛奶、大豆过敏原成分的快速定性检测.结果表明:通过免疫和杂交瘤技术分别获得了抗β-酪蛋白和β-伴球蛋白的单克隆抗体,纯化后2种抗体的效价均达到1∶1×107,通过免疫兔制备的2种多克隆抗体经纯化后效价在1∶2×105左右;所建立的双抗夹心ELISA方法的最低检测限为15ng/mL,与其他物种的蛋白不发生交叉反应,具有良好的特异性.这为建立乳品掺假及过敏原成分快速检测奠定了基础.     

牛妊娠相关糖蛋白boPAG2双抗体夹心ELISA体系的建立

【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10~4)～(1∶11.96×10~4),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步鉴定。     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

鸡肉中氟苯尼考ELISA检测方法的建立及应用

 【目的】制备抗氟苯尼考（FFC）的高亲和力特异性抗体,建立检测氟苯尼考的间接竞争ELISA新方法。【方法】氟苯尼考分别与牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）经混合酸酐法偶联,得到免疫抗原和包被抗原,其偶联比分别为14.4和14.7。用免疫原FFC-HS-BSA免疫新西兰大白兔获得了效价较高的特异性抗体。建立并优化了间接竞争ELISA检测方法。【结果】抗血清效价为1﹕102 400。最佳包被抗原浓度为0.5 μg?ml-1,最佳抗体工作浓度为1﹕6 400,酶标二抗的工作浓度为1﹕20 000。回归方程Y = -0.1516X + 0.788（R2 = 0.9859）,检测范围为0.18～500 ng?ml-1,检出限为0.18 ng?ml-1,批内和批间平均变异系数分别为4.86%和7.77%。交叉反应试验中,抗血清与FFC结构相似的氯霉素和甲砜霉素交叉反应率分别为0.094%和0.098%,与其它药物交叉反应率均小于0.01%,表明该方法具有很强的特异性。FFC以浓度0.18～500 ng?g-1在鸡肉中添加,回收率为84.14%～106.1%,变异系数为2.1%～5.6%。【结论】成功获得了高效价、高特异性的抗FFC抗体,建立了鸡肉中氟苯尼考残留检测的ELISA方法。结果表明,所建立的检测方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点。     

优球蛋白法纯化南方鮎血清免疫球蛋白及多克隆抗体制备

采用优球蛋白法和Sepharose-4B柱层析纯化南方鮎血清免疫球蛋白,SDS-PAGE结果表明,重链相对分子质量约为7.4×104,轻链相对分子质量约为2.6×104;用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定多克隆抗体效价高达1∶216;Western-blotting结果显示多克隆抗体与免疫球蛋白重链和轻链都有反应,与不同科的沟鮎血清和不同目的草鱼血清无交叉反应.利用优球蛋白法和Sepharose-4B柱层析首次纯化南方鮎血清免疫球蛋白,与Sepharose-4B柱层析相比优球蛋白法更简单、快速;制备的多克隆抗体具有特异性,可做为以后进一步研究南方鮎的免疫系统和免疫防治的工具.     

马铃薯疮痂病菌(Streptomyces scabies)的血清学检测

以马铃薯疮痂病菌RB5(Streptomyces scabies)的菌丝-孢子为抗原免疫家兔,制备了抗血清AsRB5,并采用琼脂双扩散和酶联免疫吸附试验对抗血清进行特异性测定,结果表明,供试的10 株马铃薯疮痂病菌,1 株玫瑰黄链霉菌和1株玫瑰暗黄链霉菌与AsRB5 反应为阳性,其他15 株疮痂链霉菌与AsRB5 反应为阴性,作为对照的棉花黄萎病菌、立枯病菌、炭疽病菌与AsRB5 反应为阴性。以上结果表明,使用抗血清AsRB5 检测马铃薯疮痂病菌,基本上可以将其鉴定到种的水平上。但不能对同种内菌株进一步区分或进行多样性评价,并且这种鉴定与其地理来源及寄主无关。     

牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exon)融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exons) 融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了检测牛双芽巴贝斯虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10;.HSP20间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛双芽巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅲ.病害的病原性质

水稻条纹叶枯病系由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)所致.病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式并经卵传播,介体灰飞虱有明显的间歇传毒现象.提纯病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收曲线,最大吸收260nm,最小吸收245nm,A260/280=1.54.病毒粒体长丝状,粒体直径约8nm,与日本的水稻条纹病毒抗血清呈阳性反应.将提纯病毒制剂免疫家兔制备抗血清,其效价可达1∶2048.采用该抗血清,通过免疫扩散和ELISA间接法反应,可很灵敏地检测病叶中的RSV.