牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与序列分析

采用PCR技术,从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tams1基因,该基因长度为846 bp,编码281个氨基酸.同源性分析表明,该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93.6%～99.8%,氨基酸同源性为88.6%～99.6%.系统发育进化树分析表明,新疆分离株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非共和国株进化途径一致,与苏丹株和巴林株进化途径相差较远.氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇.     

牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因的克隆表达及其重组蛋白免疫原性

本试验将新疆株牛巴贝斯虫的MSA-2c基因克隆,并构建重组质粒pGEX-4T-2/MSA-2c.利用大肠杆菌原核表达系统进行外源蛋白的表达,并成功诱导出GST-MSA-2c融合蛋白.通过优化诱导条件,得到了较高的可溶性表达;利用亲和层析技术纯化后的重组蛋白皮下免疫试验小鼠.间接ELISA检测发现,免疫接种56 d后,抗重组蛋白的抗体效价达到1∶220 000以上.用获得的抗血清进行Western-blot试验,可获得清晰的免疫反应条带.结果表明,本试验所表达的MSA-2c蛋白与文献报道的目的蛋白相符,并具有免疫原性.同时本试验也为建立以MSA-2c重组蛋白作为抗原的血清学诊断体系奠定了基础.     

新疆牛环形泰勒虫Tamsl基因的克隆与序列分析

采用PCR技术，从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tamsl基因，该基因长度为846bp，编码281个氨基酸。同源性分析表明，该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93．6％～99．8％，氨基酸同源性为88．6％～99．6％。系统发育进化树分析表明，新疆分离株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非共和国株进化途径一致，与苏丹株和巴林株进化途径相差较远。氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇。     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础.     

PRRSV新疆分离株的ORF5序列分析与同源性比较

采用RT-PCR技术,分别对PRRSV新疆分离株XJ-a,XJ-b,XJ-c的ORF5片段的ORF5基因进行扩增,获得长度为603 bp的特异性目片段.ORF5片段序列分析表明,新疆3个分离株的ORF5基因与欧洲型PRRSV毒株序列核苷酸的同源性为56.1%～56.4%,与标准美洲型PRRSV毒株序列的核苷酸同源性达到86.6%～87.2%,与国内部分省市流行株的同源性在96.0%～99.2%.PRRSV新疆分离株属于北美洲型PRRSV的变异毒株,属同一亚型,毒株间也存在一定的差异,具有高度致病性的生物学特征.     

牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因重组质粒的构建、真核表达及其免疫反应性研究

根据GenBank公布的牛巴贝斯虫裂殖子表面抗原MSA-2c基因序列设计引物,采用PCR方法从患病牛的全血基因组中扩增得到798 bp的MSA-2c基因片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达MSA-2c基因,取其肝脏提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增可得到目的条带;用重组质粒pcDNA3.1( )-MSA-2c肌肉注射免疫小白鼠4次后,将获得的抗血清作为抗体,纯化的GST-MSA-2c融合蛋白作为抗原进行Western-blot检测,可得到抗原-抗体结合产生的特异性条带,表明重组质粒具有免疫学活性.     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

以田间分离的轮状病毒CHLY(G6型)作为抗原,建立了犊牛轮状病毒(BRV)抗体检测与监测的间接ELISA方法.田间监测牛轮状病毒感染率为32.91%(26/79),疫苗源性抗体高峰出现在二次免疫后第40天至第60天,抗体持续期为3个月.该方法可用于粪便、血清样品的检测,具有特异性强、快速简便等优点,适合于对轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测.     

泸州市宠物犬真菌性皮肤病的流行病学调查

为了解泸州市宠物犬的真菌性皮肤病的发病情况和流行特征,该文以泸州欣旺动物医院等3家宠物医院接诊(2015年6月至2017年5月)的病例为研究对象,开展了全市犬真菌性皮肤病的流行病学调查。结果表明,上海市真菌性皮肤病的病原以犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣病为主;感染发病主要集中在2岁以内的犬只,雌性犬病例略多于雄性,其中贵宾犬、北京犬的发病率最高;病灶分布以四肢居多;存在季节流行差异,夏季病例多于其他季节。     

新疆克拉玛依地区奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定

用兰州乳房炎检测试剂(Lanzhou mastitis test,LMT)对克拉玛依规模化奶牛场进行了奶牛隐性乳房炎流行病学调查。结果显示,该地区奶牛隐性乳房炎的发病率为70.43%(543/771)。对543份阳性牛乳样品进行了病原菌的分离鉴定,结果发现,阳性乳样品中细菌分离率达89.13%(484/543),葡萄球菌、链球菌、肠杆菌和棒状杆菌为主要致病菌,且多为几种致病菌的混合感染。