牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因的克隆表达及其重组蛋白免疫原性

本试验将新疆株牛巴贝斯虫的MSA-2c基因克隆,并构建重组质粒pGEX-4T-2/MSA-2c.利用大肠杆菌原核表达系统进行外源蛋白的表达,并成功诱导出GST-MSA-2c融合蛋白.通过优化诱导条件,得到了较高的可溶性表达;利用亲和层析技术纯化后的重组蛋白皮下免疫试验小鼠.间接ELISA检测发现,免疫接种56 d后,抗重组蛋白的抗体效价达到1∶220 000以上.用获得的抗血清进行Western-blot试验,可获得清晰的免疫反应条带.结果表明,本试验所表达的MSA-2c蛋白与文献报道的目的蛋白相符,并具有免疫原性.同时本试验也为建立以MSA-2c重组蛋白作为抗原的血清学诊断体系奠定了基础.     

新疆牛梨形虫病单一与混合感染的流行病学调查

【目的】分别以纯化的重组蛋白GST-MSA-2c、GST-HSP20、GST-Tams1作为抗原,对2006～2008年全疆14个地州的牛梨形虫病流行病学进行调查。【方法】使用三种已建立的牛梨形虫病间接ELISA检测方法。【结果】(1)在三年采集的1340份血清样品中共检出牛梨形虫阳性血清280例,感染率为20.90%,其中牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、泰勒梨形虫单一感染率分别为8.21%(23/280)、15.71%(44/280)和43.93%(123/280)。(2)新疆牛梨形虫混合感染上升,为15.35%,甚至出现个别的三重感染。(3)2008年在流行区内的牛梨形虫感染率高达74%(37/50),单一感染和混合感染分别64.85%(24/37)和35.15%(13/37),流行区的混合感染率明显增高。【结论】新疆牛梨形病的流行病学特征是感染率逐年增加,疫区不断扩大,混合感染使疫情趋于复杂化。这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛梨形虫病进行大规模的流行病学调查。     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学诊断方法的建立

[目的与方法]在优化表达牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白和建立ELISA反应条件的基础上,进-步探讨牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白及其所建立的ELISA检测方法的特异性,从而建立牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法.[结果]牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA检测方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白抗原建立的牛巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与序列分析

采用PCR技术,从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tams1基因,该基因长度为846 bp,编码281个氨基酸.同源性分析表明,该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93.6%～99.8%,氨基酸同源性为88.6%～99.6%.系统发育进化树分析表明,新疆分离株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非共和国株进化途径一致,与苏丹株和巴林株进化途径相差较远.氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇.     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%.经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.     

新疆牛巴贝斯虫病的流行病学调查

[目的]2006～2008年对全疆14个地州的牛巴贝斯虫病进行流行病学调查.[方法]使用已建立的牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST - MSA -2作为抗原.[结果](1)新疆存在着牛巴贝斯虫病.在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清7份,感染率为2.52;.在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清32份,感染率为3.13;.在2008年的530份牛血清中检出阳性血清43份,感染率为5.28;.(2)2008年在地方流行性疫病区牛巴贝斯虫感染率高达28;.(3)牛巴贝斯虫病所在的地州由2006年的5个扩大到2008年的11个.[结论]新疆牛巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增,牛巴贝斯虫病的防治不容忽视.这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查.     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗象间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg／mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10％。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。     

牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exon)融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exons) 融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了检测牛双芽巴贝斯虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10;.HSP20间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛双芽巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查

本研究使用牛双芽巴贝斯虫HSP20（exon）-iELISA检测方法,对2006-2008年新疆14个地州市的牛双芽巴贝斯虫病流行病学进行了调查。结果显示：（1）新疆存在着牛双芽巴贝斯虫病,且比牛巴贝斯虫病严重。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为5.40%。2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清25份,感染率为4.70%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清53份,感染率为7.17%;（2）2008年,发病疫区内牛双芽巴贝斯虫感染率高达30%;（3）牛双芽巴贝斯虫感染的地州市由2006年的8个扩大到2008年的13个;（4）新疆牛双芽巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增。这是新疆首次利用血清学方法对全疆范围内牛双芽巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查。