高粱SbNAC1基因克隆及初步分析

【目的】在植物抗逆信号转导途径中,NAC转录因子处于承上启下的关键位置,通过调控靶基因的表达发挥抗逆功能。本研究克隆高粱SbNAC1基因全长cDNA,并对其进行序列比对、进化分析,为深入研究其在作物抗逆反应中的生物学功能奠定基础。【方法】RT-PCR扩增SbNAC1全长cDNA,并对其进行基因序列比对和系统进化分析等生物信息学分析。【结果】SbNAC1cDNA全长966bp,编码321个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明高粱SbNAC1与水稻SNAC1同源性达到83.69%。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊LDH-A基因cDNA的克隆与特性分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A（LDH-A）基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′ RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp 的3′ UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。【结论】内蒙古白绒山羊LDH-A基因编码的蛋白具有典型的乳酸脱氢酶结构,cDNA核苷酸序列与牛的LDH-A基因（NM_174099.2）具有较高的同源性。在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。     

中药青天葵黄酮醇合成酶基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆中药青天葵黄酮化合物生物合成途径的关键调控酶—黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并分析其序列特征及编码蛋白的功能。【方法】在前期青天葵转录组测序获得的FLS基因序列片段的基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE-PCR)克隆FLS基因的cDNA全长及其编码区;利用生物信息学方法对其编码蛋白进行同源性比对和功能分析。【结果】青天葵FLS基因cDNA全长1268 bp,其中包含993 bp的开放阅读框,编码331个氨基酸。编码蛋白的氨基酸序列预测显示,青天葵FLS蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子量约为37.3 kDa;不含有信号肽、转运肽和跨膜结构域,可能定位于细胞质中;具有黄酮醇合成酶保守功能域,与铁皮石斛等同科植物FLS蛋白的同源性可达82%。【结论】成功克隆了青天葵黄酮醇合成酶基因,为后续的基因功能鉴定和生物合成调控,进而提高青天葵黄酮类药效成分积累奠定了基础。     

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

烟草转录因子NtMYB42基因的克隆与分析

【目的】克隆烟草木质素生物合成途径调控基因NtMYB42,为烟草品质改良提供参考依据。【方法】利用同源克隆法从栽培烟草K326克隆出NtMYB42基因全长序列和cDNA序列,研究分析NtMYB42基因的结构、编码蛋白理化性质、亚细胞定位和同源性等。【结果】NtMYB42基因组和cDNA全长分别为2 312bp和1 130bp,包含2个外显子和1个内含子,编码281个氨基酸,分子量为31.79kD,等电点pI为5.18,预测有3个糖基化位点和18个磷酸化位点;NtMYB42与SlMYB42等植物MYB42蛋白同源性水平较高,与SlMYB42一致性达82.6%。【结论】从K326中克隆出NtMYB42基因全长序列和cDNA序列,NtMYB42是番茄SlMYB42、矮牵牛PnODO1和拟南芥AtMYB42的同源基因,是烟草木质素合成途径调控的重要候选基因。     

月季MYB基因cDNA全长克隆和表达分析

 【目的】克隆月季花色代谢相关新基因的全长cDNA序列,并分析其表达功能。【方法】根据月季花色突变体SSH文库分析得到的差异表达EST序列设计引物,采用RACE技术进行全长cDNA克隆。【结果】克隆到1 125 bp的cDNA全长,GenBank登录号为Eu082130。这一cDNA序列编码1个包含294个氨基酸的前体蛋白,它与小金海棠MxMYB1和大豆的GmMYB176 蛋白的保守区同源性分别为70%和58%,都是只有1个MYB结构;而与具有两个MYB结构域的棉花GhMYB26、拟蓝芥AtMYB305和金鱼草AmMYB340同源性很低。该蛋白的分子量为32.33 kD,等电点为9.65,分子式为C1387H2201N435O440S10 。半定量PCR 分析证实了该RhMYB1基因与CHS基因在红花突变体中比在黄花亲本中表达量高。【结论】推测该基因是一个转录因子,参与调控花青苷的合成。     

甜菜夜蛾细胞色素P450基因的克隆与分析

【目的】探索甜菜叶蛾产生抗药性的分子机制。【方法】利用RACE技术,从甜菜夜蛾Spodoptera exigua中克隆获得1个细胞色素P450基因的全长cDNA序列。【结果】该基因全长894 bp,开放阅读框411 bp,3′和5′端非编码序列分别为79和213 bp,推导的氨基酸序列编码194个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为22.30 kDa,等电点为8.22。同源性比对分析发现,甜菜夜蛾细胞色素P450基因与斜纹夜蛾Spodoptera litura、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae、棉铃虫Helicoverpa armigera和谷实夜蛾Helicoverpa zea细胞色素P450的相似性分别为42%、41%、39%和42%。【结论】研究结果可为今后深入研究甜菜夜蛾细胞色素P450功能提供借鉴和参考。     

中国水仙锌指蛋白NtPLATZ1的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙植物AT富集序列锌结合蛋白基因(NtPLATZ1),为研究该基因的生物学功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆了NtPLATZ1cDNA全长,利用生物信息学方法分析其核苷酸及氨基酸序列,将NtPLATZ1与原核表达载体pGEX-4T-3连接,转化BL21并进行诱导表达,通过半定量PCR分析用多效唑处理后该基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达情况。【结果】NtPLATZ1的cDNA全长1 024bp,包含1个642bp的完整阅读框架,编码213个氨基酸;编码蛋白具有PLATZ superfamily蛋白保守区,与大豆(Glycine max,AII19314.1)PLATZ蛋白序列的同源性最高,为81%。原核表达结果表明,NtPLATZ1在大肠杆菌中能有效表达。半定量RT-PCR分析表明,喷雾多效唑后,NtPLATZ1基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达量先上升后下降,抽葶期叶片的表达量最高;喷雾清水后NtPLATZ1基因表达量先下降后又有所回升,抽葶期和始花期的表达量低于长叶期和盛花期。【结论】成功克隆了中国水仙NtPLATZ1基因,多效唑处理能明显诱导该基因的表达。     

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。