绵羊皮肤组织VEGF-A基因可变剪切体存在的证实与鉴定

为了克隆绵羊血管内皮生长因子A(VEGF-A)基因,探寻该基因与绵羊毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,试验采用RT-PCR方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-A基因mRNA并对其进行生物信息学分析。结果表明:以皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增出3条特异性条带;克隆测序结果显示所有条带均为VEGF-A基因序列,片段长度依次为828,825,756,624 bp。828 bp和825 bp片段属于全长VEGF-A,其中825 bp片段在3′非编码区缺失3个碱基;756 bp和624 bp片段由可变剪切产生,分别为外显子6缺失和外显子6,7双缺失,编码蛋白与人类VEGF-A165和VEGF-A121类似;核苷酸序列比对发现,VEGF-A基因mRNA仅存在3个SNP位点;蛋白结构域分析发现,三种类型VEGF-A蛋白均含有完整的血小板衍生生长因子(PDGF)结构域。说明试验成功地从绵羊皮肤组织中克隆到VEGF-A基因并证实可变剪切突变体的存在。     

绵羊VEGF-B基因可变剪切体克隆与鉴定

为克隆绵羊血管内皮生长因子B(VEGF-B)基因,探寻该基因与毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,本文利用RT-PCR从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-B基因mRNA并对不同组织中VEGF-B基因表达进行分析。扩增显示存在2条扩增条带,克隆测序发现均为VEGF-B基因,大小为978 bp和877 bp。分析发现片段中间部位缺失导致编码氨基酸序列改变,但并未破坏PDGF功能结构域,仅引起一端蛋白酶切位点改变。不同组织器官中两突变体表达检测发现具有组成型表达的特点。定量检测发现VEGF-B在肺脏和卵巢组织中较心脏组织表达升高,脾脏、肾脏与心脏表达持平。肠道、肝脏、脑及肌肉组织则表达降低。本研究成功克隆了绵羊VEGF-B基因并对其进行了系统的鉴定分析,为进一步研究绵羊VEGF家族功能奠定基础。     

应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签

为寻找与绵羊羊毛生长相关的基因,应用mRNA差异显示技术(DD-PCR)筛选拔毛皮肤与正常皮肤表达水平有差异的cDNA,用Northern blot证实差异显示基因片段,对差异基因进行测序和同源比较。经差异显示分析,共找到差异表达的序列片段21个;经2次扩增、克隆、Northern Blot分析,最终确定2个差异条带SQ70和SQ75。对这两个差异条带进行测序及生物信息学分析,发现SQ70是绵羊皮肤中与组织修复相关的EST片段,而SQ75是绵羊皮肤或者是毛囊中高表达的未知EST片段。以上结果表明,SQ70和SQ75可能是与绵羊羊毛生长密切相关的基因表达产物,对于这两个ESTs具体的生物学功能有待于进一步研究。     

绵羊松果体及生殖轴系褪黑素受体MT1的克隆

采用RT-PCR技术从绵羊松果体、下丘脑、垂体及卵巢组织中克隆到褪黑素受体MT1基因,扩增序列全长650 bp.同源性分析表明与GenBank中已知序列的同源性均达到99%,证明这些组织存在MT1基因的mRNA表达.序列分析发现绵羊下丘脑、垂体和卵巢组织中的基因序列为Mella α基因,而松果体组织中的基因序列为Mella β基因.绵羊卵巢组织中存在有MT1褪黑素受体,暗示褪黑素可能直接作用于绵羊卵巢,参与生殖功能的调节.     

绵羊妊娠期生殖组织Flt-1基因的克隆及其组织表达量的检测

试验从雌性绵羊妊娠期不同阶段的输卵管、子宫内膜、卵泡组织中提取总RNA,根据已发表的绵羊Flt-1基因的cDNA序列设计引物,以β-Actin基因为内参,采用RT-PCR扩增绵羊Flt-1基因,将扩增产物克隆于载体后进行序列分析,并应用Kodak Science 1 D、Bandscan图像分析软件,推断出不同组织中Flt-1基因的表达量。结果表明,从雌性绵羊妊娠期不同阶段生殖道各组织上皮均获得82 bp的Flt-1基因的扩增片段,且Flt-1基因在雌性绵羊生殖道各组织内的表达量不同。说明Flt-1基因对绵羊的妊娠维持起着重要的作用。     

绵羊妊娠期生殖组织VEGF基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性绵羊妊娠期不同阶段的输卵管、子宫内膜、黄体组织中提取总RNA,根据已经发表的绵羊的Flt-Ⅰ基因的cDNA序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出绵羊VEGF基因;将扩增产物克隆于裁体后进行序列分析,以基因为内参,对扩增的VEGF基因进行琼脂糖凝胶电泳后,应用,推断出不同组织中Flt-Ⅰ基因的表达量.结果表明:从雌性绵羊妊娠期不同阶段生殖道各组织上皮均获得82 bp的VEGF基因的扩增片段,且VEGF基因在雌性绵羊生殖道各组织内的表达量不同.说明VEGF基因对绵羊的妊娠维持起着重要的作用.     

猪IP-10蛋白真核表达载体的构建

根据GenBank上发表的猪IP-10蛋白的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片段,将扩增产物连接到表达载体pcDNA3.1上,进行序列测定和分析。结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为312bp,共编码104个氨基酸。该基因片段与已发表的猪IP-10蛋白基因核苷酸序列同源性为100%,氨基酸同源性为100%。本试验为重组猪IP-10蛋白的生产及功能研究奠定了基础。     

中国新吉细毛羊LHx2基因cDNA克隆与序列分析

以供试羊皮肤组织中提取的总RNA为模板,根据Gen Bank中登陆的绵羊LHx2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增RT-PCR合成的LHx2基因编码区第一链c DNA,回收、纯化反应产物,将目的基因与p MD18-T载体连接、转化,获得阳性重组质粒,成功克隆新吉细毛羊LHx2基因c DNA序列,测序长为1 215 bp。基因同源性分析结果显示各物种间同源性均在80%以上。该基因编码405个氨基酸残基,蛋白同源性分析结果显示各物种间同源性差异较大;蛋白二级结构分析显示LHx2蛋白为疏水性蛋白、柔韧性较高;蛋白结构域分析结果表明克隆的基因较为完整。研究结果为深入研究新吉细毛羊LHx2基因提供理论基础。     

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。     

9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因克隆及蛋白序列分析

[目的]克隆绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因,比对、分析不同菌株P113蛋白序列,为研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的生物学功能提供参考。[方法]设计绵羊肺炎支原体P113基因特异性引物,采用PCR方法扩增9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株的P113基因片段;对获得的9株绵羊肺炎支原体P113基因片段进行测序分析,将DNA序列翻译为氨基酸序列,对不同菌株的P113氨基酸序列进行比对。[结果]不同分离株P113基因片段扩增产物大小不同。氨基酸序列分析显示,C末端序列重复区域长度存在差异,以KKAEGA（S）QNQG为主要重复序列单元。不同菌株重复序列单元数量不同,NM01-MO株和CK-MO株的重复序列单元数量最多,为16个;LK-MO株重复序列单元数量最少,为3个;多数菌株之间重复序列单元数量差异较大。[结论]绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113氨基酸序列的C末端重复序列单元数量不同,这些不同数量的重复序列影响P113蛋白结构,进而可能影响其生物学功能。     

绵羊Gfrα1基因的部分cDNA克隆与抗原表位多肽的原核表达

旨在克隆绵羊Gfrα1基因序列,深入研究绵羊精原干细胞(SSCs)。本研究通过RT-PCR扩增和分子克隆的方法克隆到了绵羊Gfrα1基因的编码区大部分片段。结果,克隆得到的绵羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列长1 312bp,包括1 311bp的开放阅读框(ORF),编码437个氨基酸,与牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相应核苷酸序列的同源性分别为98.5%、91.3%、91.0%、88.9%和88.0%。根据获得的cDNA序列,预测已知片段的抗原表位区,并将抗原表位区序列插入pET-44a(+)载体,经转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,并通过亲和柱层析,纯化制备GFRα1抗原表位多肽。Western blot检测发现,经诱导表达的GFRα1抗原表位多肽约为18.2ku,与预测的大小一致。绵羊Gfrα1基因的克隆和表达研究,为进一步制作该基因的多克隆抗体奠定基础,为绵羊SSCs的分子水平鉴定及功能分析提供了研究条件。     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增,扩增产物经克隆和测序显示,其长度为1 893bp,该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H-FABP基因第2内含子分别有99%和66.4%的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H-FABP基因第2内含子中174 bp的序列进行了PCR-SSCP分析,结果未检测到多态性。     

新疆细毛羊KAP6.1基因的克隆及序列分析

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。     

新疆地区绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与表达载体构建

目的,克隆新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因片段。方法,以新疆地区绵羊种布鲁氏菌(80/019)菌株的基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增基因片段,通过T4DNA连接酶将扩增基因片段连接于PBS-T克隆载体上,酶切鉴定、测序、分析。结果,通过PCR技术扩增的Omp31基因片段为723bp,该片段与国际标准菌株绵羊种核苷酸序列相比同源性达98.76﹪,与国际标准菌株犬种核苷酸序列相比同源性达99.86﹪,与国际标准菌株猪种、海洋种核苷酸序列完全相同。结论,获得的目的基因与文献报的基因序列基本一致,但有一定差异。其同源性很高,为进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白的免疫特性及开发基因工程疫苗奠定了基础。     

绵羊痘病毒HB株的分离鉴定

从华东感染的绵羊中分离到一株病毒,命名为HB株。根据已发表的绵羊痘病毒的基因序列设计了一对引物,采用PCR方法从病毒HB株总DNA中扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD-18T载体中,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆株进行了序列测定和序列分析。扩增所得的HB株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.5%~100%。研究结果证实分离毒株为绵羊痘病毒。     

绵羊痘的PCR检测与诊断

绵羊痘是痘病的其中之一,也是世界动物卫生组织通报和跨界的重要羊病之一,给世界养羊业带来巨大的经济损失。绵羊痘的主要特征是在绵羊的皮肤和黏膜上形成痘疹。本研究根据数据库中最新发表的绵羊痘病毒P32基因序列,设计并合成了1对能特异性扩增绵羊痘病毒基因片段的特异性引物序列,建立了检测与诊断绵羊痘的PCR方法,扩增产物大小为500 bp。结果显示,绵羊痘均能扩增出条带,其他健康羊只均不能扩增出条带。应用本研究建立的方法对临床样本进行检测与诊断,10份临床疑是病料中6份均可扩增出500 bp的绵羊痘病毒特异性片段。该方法可用来绵羊痘的诊断、检测、预防控制及流行病学调查。     

藏系绵羊KRT26基因的克隆测序和组织表达分析

为了克隆藏系绵羊KRT26基因序列,并研究其组织表达谱,试验从藏系绵羊皮肤中提取总RNA,用RT-PCR技术克隆KRT26基因,并进行了氨基酸序列测定和荧光定量PCR分析。结果表明:获得了1 407 bp的编码区序列,该序列与绵羊KRT26基因的预测序列仅有1个碱基差异,推导的氨基酸序列相同,与牛、人、小鼠KRT26的氨基酸序列相似性依次为94.44%、79.44%和73.32%。KRT26基因在藏系绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、皮肤中均有不同程度表达,但在皮肤的表达量远远高于其他组织,表现出极高的组织特异性。     

青海藏系绵羊BMP2基因的克隆及其序列分析

从青海藏系绵羊的皮肤中提取总RNA,根据其他物种BMP2基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术首次扩增出藏系绵羊BMP2DNA序列,提交至GenBank,并已取得序列号HM066200.将此片段克隆到pMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证.结果显示,该DNA序列为356 bp的部分CDS区,编码118个氨基酸.证实所克隆序列为BMP2,符合BMP2基因的特征.     

和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM₀01009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

布莱凯特黑牛CB1基因克隆测序及表达分析

本试验旨在研究布莱凯特黑牛CB1基因CDS区序列和表达情况,探讨CB1基因与脂肪沉积的关系。运用RT-PCR技术克隆CB1基因CDS区序列,并进行生物学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织的mRNA相对表达量;以及运用免疫组化技术对蛋白进行定位分析,运用Western blot技术检测CB1蛋白在不同组织的表达量。结果显示,克隆获得的布莱凯特黑牛CB1基因CDS为1495 bp,编码477个氨基酸。进化树显示布莱凯特黑牛CB1基因与牛、山羊、绵羊同源性最高(>98%)。qRT-PCR结果显示CB1基因在不同组织均有表达,在脂肪组织中相对表达量最高;免疫组化显示CB1基因主要在脂肪细胞膜上表达;Western blot结果显示CB1蛋白在脂肪组织和肌肉组织均有表达,在脂肪组织表达量显著高于肌肉组织。综上推测,CB1基因参与脂质代谢相关调节过程,为肉牛肉质性状的分子选育提供参考。