新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。     

巴什拜羊ISG15基因的克隆与序列分析

本研究旨在了解新疆巴氏拜羊类泛素蛋白ISG15基因的序列特征。采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到淋巴细胞并提取RNA,设计特异性引物进行RT-PCR,克隆出巴什拜羊ISG15基因序列,回收PCR产物与pMD18-T载体连接后转化DH5α,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。结果表明,克隆的巴什拜羊ISG15基因编码区全长为522 bp,编码172个氨基酸。BLAST结果表明,巴什拜羊ISG15基因与绵羊、山羊、小尾寒羊、水牛、牛和野猪的ISG15基因序列同源性分别为99%、98%、95%、94%、94%和82%。构建基因进化树分析结果显示,巴什拜羊与绵羊先聚为一类,再与小尾寒羊聚为一类,然后和牛聚为一类。该聚类结果与生物学上的分类一致。     

动物源粪肠球菌对7种抗生素耐药表型及耐药基因检测

为查明动物源(牛、羊、猪、鸡)粪肠球菌分离株对7种常见抗生素的耐药情况(包括耐药表型及相关的耐药基因),采用药敏纸片法、浓度稀释法和VITEK-AMS全自动药敏法3种不同的方法,根据CLSI(2007)判定标准,检测40株分离株的耐药表型;采用聚合酶链反应(PCR)方法,检测分离株中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类抗生素耐药相关基因(aac(6’)/aph2’’,aph(3’)-Ⅲ,ant(6)-I)、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(ermB,mefA)和万古霉素耐药相关基因(vanA,vanB,vanC)。结果表明,分离株对庆大霉素、链霉素、四环素、红霉素、青霉素、阿莫西林表型耐药率分别为:60.0%(24/40),57.5%(23/40),52.5%(21/40),67.5%(27/40),60.0%(24/40),55.0%(22/40),本试验中未发现耐万古霉素粪肠球菌。耐药基因aac(6’)/aph2’’,ant(6)-Ⅰ,aph(3’)-Ⅲ,tetM,ermB,TEM的检出率分别为:55%(22/40),55%(22/40),25.0%(10/40),42.5%(17/40),50.0%(20/40),45.0%(18/40);未检测到mefA,vanA,vanB,vanC基因的菌株。动物源性粪肠球菌多重耐药现象严重,携带抗生素相关耐药基因是导致分离株对抗生素产生耐药的主要原因,从耐药表型和基因型的角度均可证实分离株粪肠球菌具有多重耐药性。     

新疆细毛羊KAP6.1基因的克隆及序列分析

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。     

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。