RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立

为了直观、高效、特异性地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞和组织中PRRSV RNA,本研究根据HP-PRRSV Hu N4株ORF7基因序列设计8对28 bp~36 bp双"Z"结构的寡核苷酸探针(PRRSV-Nprobes),建立了一种新的PRRSV RNA原位杂交检测的方法。该方法能特异性的检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中PRRSV RNA,而对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)感染PAMs中的核酸呈现阴性。应用该方法检测PRRSV感染仔猪肺脏、腹股沟淋巴结和胸腺石蜡包埋组织切片中PRRSV RNA,在感染的腹股沟淋巴结中PRRSV RNA呈现集中分布,而PRRSV RNA在肺脏和胸腺中呈弥漫性分布。该方法可用于细胞和组织中核酸的定位及分布规律的研究,特别是用于病毒含量较少的潜伏感染的检测,为PRRSV实验室检测和致病机理研究奠定了良好的试验基础和技术支持。     

特异性中和抗体终止猪体内猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（VR-2332）的ORF6及ORF7部分保守序列，设计合成1对特异引物，通过优化RT—PCR反应条件，建立了从血清中检测PRRSV RNA的RT—PCR诊断方法。60日龄仔猪经鼻腔接种1mL 10^5.6TCID50/／mL PRRSV强毒液，7d后肌肉注射中和效价为1：64的特异性高免血清，每隔1周利用RT—PCR检测猪体内PRRSVRNA，5周内PRRSV RNA检测均为阴性，表明高滴度特异性中和抗体完全终止了PRRSV感染猪体内的病毒复制。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病混合感染的诊断

为了解信阳某猪场发病仔猪死亡原因,通过流行病学调查、病理解剖、伪狂犬病毒PCR检测、PRRSV的PCR检测、PRRSV分离株ORF5基因的PCR扩增及序列分析等方法,对该猪场发病猪进行了诊断。结果表明,该猪场猪只为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV)和伪狂犬病病毒（PRV）的混合感染。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF7基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出394 bp的cDNA。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物,并以此为模板制备出地高辛标记的cDNA探针。特异性试验表明,该探针仅与PRRSV核酸反应,与PPV、PRV、FMDV、HCV及PCV2的核酸反应为阴性。敏感性检测表明,采用CSPD化学发光检测时,硝酸纤维素膜上最低检出量为62.5 pg;尼龙膜上最低检出量为0.5 pg。应用该探针,在尼龙膜上对10份PRRSV阳性病料的组织RNA样品进行检测,结果均为阳性,与RT-PCR检测结果一致,证明该方法可用于PRRSV临床样品检测。     

猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,在ORF2内设计1对特异性引物,利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV-2的方法。该探针与8个PCV-2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交,而与对照猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性;对PCV-2 DNA的最低检测量为10 pg。     

一例猪繁殖与呼吸综合征醮实验室诊断

2011年10月,四川邛崃某猪场发生了一种以经产母猪流产、死产、产木乃伊胎、死胎及弱仔为主要特征的疾病。为确定病原,剖解2头病死仔猪,采集肺脏、脾脏组织,混合研磨提取组织总RNA,以实验室建立猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）核酸检测方法进行这2种病原的RT-PCR检测;采集小脑组织以酚氯仿法提取组织总DNA,进行伪狂犬病毒（PRV）PCR检测。结果显示CSFV与PRV均为阴性,PRRSV变异株和经典株均为阳性。诊断为猪蓝耳病变异株与经典株混合感染。     

用地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究

利用PCR技术从带有伪狂犬病毒（PRV）gE基因的重组质粒pMD18-T-gE中扩增回收约304bp大小的片段,并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂交,而与对照的PRVBartha-k61株疫苗毒DNA、猪细小病毒（PPV）DNA、猪圆环病毒（PCV）DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRsV）cDNA、猪瘟病毒（CSFV）cDNA的杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对PRV野毒的最低检出量为4pg。应用该探针对11份繁殖障碍病料进行了杂交检测,共检出4份阳性病料,该结果与PCR检测结果一致,表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc-145细胞后，第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达，第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中，未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象；且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答，免疫期持续135d以上。结果表明，构建的PRRSV ORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染猪体内各器官组织的分布,用PRRSV SC-1株人工感染健康断奶仔猪,接毒后23 d,无菌采集试验猪器官组织,用RT-PCR检测其中病毒核酸分布情况。结果显示,心脏、脾脏、肺脏、肾脏、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、髂内淋巴结内有病毒核酸,在所有试验猪的肺脏、腹股沟淋巴结都检测到了病毒核酸。本研究结果为PRRS诊断及病毒分离鉴定提供了一定参考依据。     

高致病性猪蓝耳病病原核酸的RT-PCR检测

对高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV）Nsp2基因缺失变异特征,设计特异性引物,建立RT—PCR方法,对疑似高致病性猪蓝耳病病例进行病原核酸检测,并对扩增所得片段进行克隆测序,通过序列分析以验证RT—PCR扩增的特异性。结果表明：发病猪为高致病性猪蓝耳病病毒感染,建立的RT-PCR方法能够鉴别诊断经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病感染。     

PRRSV SD-1株ORF7基因的克隆、测序及原核表达载体的构建

参照PRRSV ATCC VR2332株基因序列设计1对引物P1、P2,经RT-PCR扩增出PRRSV SD-1株ORF7基因,经与PMD18-T Vector连接后筛选出阳性克隆株测序。把PRRSV SD-1株ORF7 cDNA亚克隆到PQE上构建PQE-N原核重组表达载体。结果表明,PRRSV SD-1株ORF7核甘酸序列与PRRSV ATCC VR2332株ORF7核甘酸序列完全一致,与欧洲株LV符合率为58%。成功构建原核表达载体PQE-N,为N蛋白的研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究

应用针对 PRRSV ATCC VR- 2 332株基因组 ORF6片段的 4 6 3bp的 c DNA探针 ,对 4 5日龄 SPF仔猪分别人工感染 ATCC VR- 2 332株及北京分离株 B96 - 4后不同时间呼吸系统及繁殖系统组织中病毒核酸的分布进行了研究。结果显示 ,在感染后 30 h,即可在鼻黏膜、气管、肺脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子宫、扁桃体等组织中检出阳性杂交信号 ,且一直持续到感染后 2 8天。其中扁桃体中病毒的数目远多于呼吸系统及繁殖系统组织中的数目 ,说明扁桃体可作为活体检查的目的器官之一     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析

试验旨在研究杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征.用Marc-145细胞从辽宁某杂交野猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)病猪血液中分离到1株病毒,该分离毒株经Marc-145细胞6次传代后出现稳定的细胞病变,采用RT-PCR方法对分离病毒进行ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,并与已知序列毒株的相应片段进行同源性比对.结果表明,分离毒株的ORF6、ORF7基因与国内外美洲型毒株的核苷酸同源性分别为96.0%～100.0%、94.5%～99.4%;氨基酸同源性分别为89.6%～100.0%、87.3%～98.7%;与欧洲型代表毒株LV的ORF6、ORF7基因差异较大,核苷酸同源性分别为70.4%、70.1%,氨基酸同源性分别为48.8%、49.7%.推测辽宁杂交野猪体内分离毒株在基因型上属于美洲型毒株.     

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001～2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析.结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001～2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRespPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006～2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ 、SD3,SD4,SD5, SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%～100%,99.4%～99.8%,99.2%～99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支.首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

参照国内外已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7的基因序列及其相关的RT—PCR检测方法设计一对引物,扩增目的片段为535bp。通过对RT—PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了一种PRRSV的RT—PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PRRSV的检测、流行病学调查等。应用此方法对临床样品进行了检测,阳性检出率达66．79／5。