江西遂川地区禽流感和新城疫病毒的监测研究

[目的]了解江西遂川地区野生鹭科鸟类携带禽流感和新城疫病毒的感染情况.[方法]于2014年10月在江西省遂川地区采集鹭科鸟类的肛拭子110份、咽拭子110份,采用SPF鸡胚进行病毒分离,通过血凝试验筛选出疑似阳性样品,然后再用RT-PCR进行鉴定.[结果]在110份被检样品中,除4份样品外,其余样品的血凝效价均为0.经RT-PCR检测,所有样品禽流感和新城疫病毒检测结果均呈阴性.这表明2014年秋季江西遂川地区野生鹭科鸟类发生禽流感和新城疫病毒感染的风险较小.[结论]该研究可为了解江西各地区野生水禽禽流感和新城疫的感染情况提供基础数据.     

3种检测方法在野鸟禽流感监测中的应用与比较

分别应用血凝抑制试验(HI)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)与病毒分离3种检测方法对260份野鸟样品开展禽流感检测。结果表明,用HI方法检出禽流感样品57份,阳性检出率为21.92%;RT-PCR方法没有检出禽流感样品,阳性检出率为0;病毒分离方法检出禽流感样品15份,阳性检出率为5.77%。     

广东清远H9亚型禽流感的分离及初步鉴定

在本次试验中,从清远养鸡场采集疑似感染H9亚型禽流感病毒鸡群的口腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,使用血凝及血凝抑制试验进行初步鉴定,提取病毒RNA,使用针对H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性鉴定引物对该分离株进行RT-PCR检测,回收特异性目的片段后进行测序分析,结果显示,该毒株属于H9亚型禽流感病毒.     

环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感监测

为了解环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感病毒的分布和流行情况,分别于2009—2011年对环洞庭湖地区活禽批发市场、2011—2013年对水禽场的H6亚型禽流感进行了系统监测。对在活禽批发市场上采集的拭子样品先由尿囊腔接种SPF鸡胚,然后用血凝试验(HA)测定所收集的尿囊液,对HA测定有滴度的再进行血凝抑制试验(HI),并与RT–PCT方法相结合鉴定病毒的亚型。检测结果显示:在环洞庭湖区的5个活禽批发市场上都分离到H6亚型禽流感,并且在鸡、鸭、鹅拭子中都分离到该病毒,总的分离率为6.49%;水禽场H6亚型禽流感病毒群体阳性率达3.6%,拭子的H6亚型病毒分离率为0.29%,活禽批发市场鸭拭子H6亚型禽流感病毒分离率为9.58%,表明市场环节水禽H6亚型禽流感的隐性带毒率比养殖环节高,在一定程度上说明禽流感在活禽批发市场存在水平传播的风险。     

H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。     

儋州市鸭高致病性禽流感免疫效果评估

为了解儋州市鸭高致病性禽流感H5和H7亚型二联灭活疫苗的免疫效果,于2020年6月在全市12个乡镇养鸭场(户)采集289份血清,采用血凝和血凝抑制试验(HA-HI)对禽流感H5、H7亚型免疫抗体进行检测.结果显示,2020年6月采集的289份鸭血清样品中,鸭禽流感H5以及H7阳性个体数分别为249、203份,免疫抗体合...     

钦州市沿海候鸟禽流感病毒带毒情况调查报告

为摸清钦州市沿海候鸟栖息和活动规律及其禽流感病毒带毒情况,组织800多人次对钦州市沿海候鸟禽流感病毒带毒情况进行调查,采集、检测脏器组织、粪便等样品462份。经对候鸟样品检测,禽流感H9亚型阳性率为0．649％,全部样品没有检出高致病性禽流感H5、H7亚型的毒株。     

黔东南州香炉山鸡H5和H7亚型禽流感流行病学调查

为科学制定香炉山鸡防控禽流感的措施提供依据,分别从散养户、商品鸡场、种鸡场采集香炉山鸡咽/泄殖腔拭子976份、958份和80份;采集相应鸡血清,利用H5和H7禽流感荧光RT-PCR、血凝及血凝抑制试验分别检测病毒核酸和免疫抗体。结果表明:散养户、商品鸡场、种鸡场H5亚型禽流感病毒核酸阳性率分别为0.51%、0.42%和0,免疫抗体合格率分别为65.78%、71.45%和86.25%;散养户、商品鸡场、种鸡场H7亚型禽流感病毒核酸阳性率分别为0.1%、0和0,免疫抗体合格率分别为63.29%、70.18%和83.75%。香炉山鸡禽流感病毒阳性群数量多,分布区域广,应加强散养鸡和商品鸡场的禽流感防控工作。     

辽宁省猪血凝性脑脊髓炎病毒抗体的血清学调查

摘要： 从辽宁省各地区采集猪血清样本,应用血凝和血凝抑制试验检测血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)抗体。结果,910份样品中有451份呈现HEV抗体阳性反应,阳性率为49.6%;抽检了10个规模化养猪场共280份样品,阳性率高达70.0%;抽查了不同年龄阶段猪血清样品,种母猪阳性率最高,为73.8%,仔猪次之,为67.5%,育肥猪最低,为37.0%。调查证明辽宁省各地区普遍存在HEV感染,被采集血清的成年猪未表现临床症状,说明HEV在本地区的猪群中主要表现为隐性感染,仔猪有少数出现症状,诊断为HEV与猪瘟或猪繁殖与呼吸综合征等混合感染。关键词：血凝性脑脊髓炎病毒;血清学调查;猪;     

鹅Ⅲ群腺病毒的分离与鉴定

采集无临床症状鹅的泄殖腔分泌物或病鹅的肠道、肝脏、脾脏，按常规方法制成接种液接种鸭胚，以血凝和血凝抑制的方法检测病毒。结果表明：从50多个样品中分离到2株腺病毒，分别命名为H5J24和N8J8。这2株病毒均能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，其凝集作用可被抗Y81G4株鹅腺病毒多抗血清所抑制，但不能被抗新城疫病毒单抗、抗H5和H9亚型禽流感病毒单抗所抑制。经形态学观察、理化特性测定和PCR检测，证明这2株病毒为Ⅲ群禽腺病毒成员。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。     

禽流感病毒H5亚型及H7亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

[目的]设计能用于多重RT-PCR扩增禽流感病毒H5、H7亚型基因的引物。[方法]在GenBank中搜索H5、H7亚型禽流感病毒的基因序列,并利用DNAStar分析其同源性,采用Primer Premier 5.0软件设计引物。[结果]多重RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示引物设计成功。[结论]该方法用于禽流感病毒的快速诊断是可行的。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

六种禽病原检测的基因诊断芯片的研制及临床应用

利用RT-PCR或PCR技术扩增出新城疫病毒（newcastle disease virus）、低致病性禽流感病毒（avian influenza）、传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus）、减蛋综合征（egg drop syndrome）、传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis）、鸡毒支原体（mycoplasma gallisepticum）基因的各一段保守序列,以纤维素膜作为生物芯片制作的基质,通过微量点样技术产生二维DNA探针阵列,即基因芯片（gene chip）。从可疑病料中提取病原核酸,通过RT-PCR掺入法标记bio-11-dUTP,将获得的标记PCR产物和基因芯片进行杂交,通过检测杂交信号的强弱来实现对生物样品的快速、高效检测及分析。芯片灵敏度高于RT-PCR和病毒分离,分别为RT-PCR和病毒分离的102倍和104倍,有忠实的特异性,动物实验结果符合率在95%以上。     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

Emergence of H5N1 highly pathogenic avian influenza in Democratic People's Republic of Korea

In the past decade, there has been extensive global surveillance for highly pathogenic avian influenza (HPAI) infection in both animals and humans, however, few studies on epidemiology of avian influenza in Democratic People's Republic of Korea (DPRK) were published. During the period 2013–2014, HPAI H5N1 viruses were detected with outbreaks in domestic poultry in DPRK. Phylogenetic analysis revealed that the hemagglutinin gene of all samples belonged to clade 2.3.2.1c with high homology. The HPAI H5N1 virus found in ducks at the Tudan Duck Farm in 2013 was might introduced by migratory birds and then led to the outbreaks on neighboring chicken farms in 2014. These data provide direct evidence for the transmission of avian influenza viruses from wild birds to waterfowl to terrestrial birds. Therefore, the monitoring and control of influenza virus in ducks must be given top priority, which are essential components to prevent and control HPAI.     

一株肉鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及其对肉鸡增重的影响

从济南地区发病鸡群中分离到一株病毒,经血清中和试验和RT—PER鉴定为H9亚型禽流感病毒（命名为DJ07）,并对其ELD加、HI相关系数及HA基因序列进行了分析,将DJ07回归试验肉鸡,发现其能显著降低试验鸡的增重率,而且降低幅度比蛋鸡源性H9要大。     

Development of a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay to detect avian influenza viruses in clinical specimens

In recent years, the avian influenza has brought not only serious economic loss to the poultry industry in China but also a serious threat to human health because of the avian influenza virus(AIV) gene recombination and reassortment. Until now, traditional RT-PCR, fluorescence RT-PCR and virus isolation identification have been developed and utilized to detect AIV, but these methods require high-level instruments and experimental conditions, not suitable for the rapid detection in field and farms. In order to develop a rapid, sensitive and practical method to detect and identify AIV subtypes, 4 specific primers to the conserved region of AIV M gene were designed and a loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) method was established. Using this method, the M gene of H1–H16 subtypes of AIV were amplified in 30 min with a water bath and all 16 H subtypes of AIV were able to be visually identified in presence of fluorescein, without cross reaction with other susceptible avian viruses. In addition, the detection limit of the common H1, H5, H7, and H9 AIV subtypes with the RT-LAMP method was 0.1 PFU(plaque-forming unit), which was 10 times more sensitive than that using the routine RT-PCR. Further comparative tests found that the positivity rate of RT-LAMP on detecting clinical samples was 4.18%(14/335) comparing with 3.58%(12/335) from real-time RT-PCR. All these results suggested that the RT-LAMP method can specifically detect and identify AIV with high sensitivity and can be considered as a fast, convenient and practical method for the clinic test and epidemiological investigation of AIV.     

2株H9N2流感病毒的分离及HA基因序列分析

为掌握近年来H9亚型禽流感的流行状况和遗传变异规律,从河南、陕西发病养殖场采集病料,用鸡胚接种法分离病毒,并用RT-PCR法对分离出的H9N2AIV的HA基因进行扩增、克隆、测序及对得到的序列进行同源性和遗传性分析。结果表明:获得了2株H9N2亚型流感病毒,这2株病毒HA基因变异程度不大,核苷酸序列和氨基酸同源性分别为97.1%和97.8%,均属于BJ/1/94分支(Y280小分支)。从分子水平分析,这2株病毒均属于低致病力的H9N2禽源流感病毒。