泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建

利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

猪FoxN1基因转录变异体亚细胞定位研究

Fox N1基因主要表达于胸腺上皮细胞和皮肤角质细胞,在胸腺发育、T细胞增殖、毛发生长、指甲发育等方面发挥重要作用。Fox N1基因存在多种转录变异体,人类Fox N1基因已发现18种转录变异体。转录变异体的存在使基因差异表达和蛋白质多样性存在可能。为深入研究转录变异体生物学功能,研究将前期发现的猪Fox N1基因3种转录变异体分别连入p EGFP-N1载体内,构建各自融合蛋白,转入猪PK15细胞,利用荧光显微镜观察转录变异体亚细胞定位情况。结果表明,p EGFP-N1空载体转染表达绿色荧光蛋白在PK15细胞核和细胞质均匀分布,而重组载体p EGFP-N1-Fox N1(a/b/c)表达的融合蛋白仅在细胞核内均匀分布。结果可为3种转录变异体后续功能研究奠定基础。     

猪细小病毒NS1基因真核表达载体pEGFP-N1-NS1的构建与表达

根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。     

小麦病程相关蛋白1基因的亚细胞定位及信号肽鉴定

前期研究克隆获得了一个叶锈菌诱导的小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1,明确了其基因结构和表达特征。本研究首先预测TaLr35PR1的信号肽和亚细胞定位情况,进而通过试验予以佐证。将信号肽编码的核酸序列克隆、连接到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,明确了TaLr35PR1基因的信号肽具有分泌功能。同时,利用酶切连接的方法成功构建亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP,利用基因枪轰击技术瞬时转化洋葱表皮细胞。结果表明,pCamA-TaLr35PR1-GFP融合蛋白主要在细胞外表达,与亚细胞定位预测的结果一致。这些研究结果丰富了小麦病程相关蛋白1基因的研究内容,为进一步探索该类基因的生物学功能及其作用机制提供了研究基础。     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。     

牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达

为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达．     

从江香猪LMF1基因的克隆、亚细胞定位及组织表达研究

为研究脂肪酶成熟因子1(LMF1)基因在从江香猪不同组织的表达情况及在真核细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR,Real-Time PCR,PSORT II Prediction软件结合荧光共定位的方法,克隆了从江香猪LMF1基因cDNA,构建了pEGFP-C1-LMF1真核表达载体,分析了LMF1基因在不同组织的表达差异和亚细胞定位情况.结果表明,从江香猪LMF1基因与GenBank上提交的其他猪种的同源性达到了100%;LMF1基因在脂肪中表达量最高,心中最低,且脂肪和小肠与其他7个组织相比,表达量均存在统计学意义(p0.01);荧光共定位结果表明,LMF1基因主要集中在细胞质中表达.相关结果对后续研究LMF1蛋白与其互作蛋白在脂质代谢的作用机理奠定的基础.     

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。     

马立克氏病病毒VP22基因siRNA筛选体系的构建

将马立克氏病病毒（MDV）超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游，构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO-k1）中，通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。     

鲤HSP90作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究

为研究鲤热休克蛋白90(HSP90)的免疫效果,根据鲤HSP90 mRNA的基因序列(GenBank),构建真核表达质粒pEGFP-C1-HSP90,并将pEGFP-C1-HSP90转染至鲤脑细胞(CCB)中,荧光倒置显微镜下观察显示,重组质粒pEGFP-C1-HSP90在CCB中成功表达;以不同免疫剂量的重组表达质粒与pIRESORF81联合免疫鲤,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫前后抗体水平。结果表明:注射重组质粒的血清中能够检测到KHV特异性抗体,其抗体水平随着免疫次数的增加而增加,第三次免疫后两周,抗体水平达到最高;联合免疫与单独免疫核酸疫苗pIRES-ORF81相比,抗体水平明显增加,但无显著性差异(P0.05)。研究表明,鲤HSP90作为锦鲤疱疹病毒的免疫佐剂具有一定的目标效果。     

猪FcRn基因及其剪接变体序列的克隆与序列

克隆并分析猪FeRn基因;十二指肠组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞.筛选阳性克隆并测序;FeRn阳性克隆两条序列在NCBI上比较,显示序列同猪FcRn(AY740682.1)同源性都为99%.克隆了猪FcRn基因的序列和其剪接变体序列,其剪接变体序列已在GenBank上注册(Accession.EU852582)     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

人外周血CD4+ T细胞F-actin的超分辨SIM成像

通过合成lifeact序列,将其克隆到pEGFP-C1载体上,构建了pEGFP-C1-Lifeact质粒,转染原代CD4+T细胞,实现对CD4+T细胞F-actin的荧光标记,结合超分辨3D-SIM荧光成像技术,研究人外周血CD4+T细胞F-actin的精细结构,并对其动力学过程进行连续观察。结果表明,CD4+T细胞F-actin分布在细胞膜周围,处于解聚和聚合的动态平衡状态,与普通荧光显微镜相比,超分辩SIM成像F-actin结构更加清晰,分辨率提高2~4倍。     

PRL-3及其同源异形体重组杆粒的构建和鉴定

目的构建PRL-3及其同源异形体重组杆状病毒表达载体,为下一步表达PRL-3及其同源异形体蛋白并从中草药活性成分中筛选出PRL-3抑制剂奠定基础。方法应用RT-PCR方法从高转移卵巢癌细胞HO-8910PM扩增PRL-3及其同源异形体编码序列,克隆到供体质粒pFastBac HTB,在DH10Bac菌中进行同源重组,经3种抗生素和蓝白斑筛选,得到Bacmid-HTB-PRL-3和Bacmid-HTB-PRL-3-variant,PCR鉴定其正确性。结果与结论成功构建了PRL-3及其同源异形体重组杆粒。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。