广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建 及其相关生物信息学分析

[目的]构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体并鉴定其活性,为深入研究CT-GF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考,也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因,并将CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上,然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞,转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白,同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析.[结果]成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区(CDS)序列,序列全长1050 bp,共编码349个氨基酸,与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%,有5处碱基突变,且均为同义突变.将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体,转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达.广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性,其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%.[结论]广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定,通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达,可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型.     

猪Sar1b基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),获得pcDNA3.1( )-Sar1b重组载体.通过菌液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3.1( )-Sar1b构建成功.     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

广西巴马小型猪PAQR3基因克隆及表达谱分析

[目的]克隆广西巴马小型猪孕激素和脂联素分子受体3(PAQR3)基因,并研究该基因在广西巴马小型猪不同组织中的表达特性,为揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增广西巴马小型猪PAQR3基因,应用在线预测软件对其功能和结构进行生物信息学分析,并以qRT-PCR分析PA QR3基因在不同组织中的表达特性及高脂高糖诱导后的表达水平.[结果]广西巴马小型猪PAQR基因编码区(CDS)序列全长936bp,编码3l2个氨基酸,与人类(XM 0067141062)、猕猴(NM 001257693.1)、牛(XM 010806259.1)、家犬(XM 014109889.1)、家鼠(XM 006534874.2)、羊(XM_012180242.1)、鸡(XM_001233720.3) PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上,其中与猕猴的亲缘关系最近,与牛的亲缘关系相对较远.PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyI Ⅱ结构域,为亲水性蛋白,有7个跨膜螺旋结构;其二级结构主要是延伸链,占31.83%;该蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白.qRT-PCR分析结果表明,PA QR3基因在广西巴马小型猪的不同组织中均有表达,以在肺脏中的表达量最高、脂肪中的表达量最低;经高脂高糖诱导后,PAQR3基因在广西巴马小型猪肝脏组织中的表达水平显著降低(P<0.05).[结论]PAQR3基因在广西巴马小型猪不同组织中广泛表达,在胆固醇和甘油三脂充裕的条件下,机体可通过下调PAQR3基因的表达量来平衡胆固醇含量.     

民猪LPL基因真核表达载体的构建

为了进一步分析脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)基因的生物学功能。采用克隆测序的方法获得了民猪LPL基因的完整CDS序列,将其克隆到pMD-18T载体上,将测序验证正确的基因序列插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,构建了pcDNA-LPL真核表达载体。结果表明,所得序列与GenBank中登录的猪LPL基因同源性为99.30%,说明LPL基因的真核载体构建成功。该研究为在细胞水平上研究LPL的表达和功能奠定了试验基础,为进一步分析LPL基因功能提供了理论依据。     

广西巴马小型猪GHRH成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响

【目的】探讨广西巴马小型猪促生长激素释放激素（GHRH）成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响,为进一步研究广西巴马小型猪GHRH成熟肽的促生长作用及GHRH基因疫苗的高效制备与安全使用提供参考依据。【方法】利用基因重组技术将广西巴马小型猪GHRH成熟肽序列与p EGFP-N1质粒连接构建重组真核表达质粒,然后按0.5μg/g的剂量肌肉注射经25%蔗糖溶液预处理的小鼠,观察记录小鼠体重变化情况,并分别提取重组质粒注射组小鼠的心脏、肝脏、肾脏及注射部位肌肉DNA,再以PCR检测是否存在基因质粒残留。【结果】以构建的p EGFP-GHRH重组质粒注射小鼠后,其外源GHRH成熟肽DNA可在肌肉中获得表达,但并未整合入小鼠基因组中。虽然重组质粒注射组小鼠的末重与空质粒注射组小鼠的差异不显著（P〉0.05）,但在注射后的10-25 d,重组质粒注射组小鼠体重均显著高于空质粒注射组（P〈0.05）。在相对日增重率方面,注射后的前15 d内,重组质粒注射组小鼠的相对日增重率均高于空质粒注射组。【结论】构建的广西巴马小型猪p EGFP-GHRH重组质粒能在一定时间内促进小鼠生长,即GHRH种属差异性小,在动物中有较高的保守性。     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

猪Ghrelin基因真核表达重组质粒的构建及免疫小鼠试验

从猪胃组织中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,经扩增得到450 bp Ghrelin基因。将其克隆到pMD18-T中,经双酶切初步鉴定后,将酶切下的目的基因进一步克隆到真核表达载体PCI中,经PCR、酶切及序列鉴定,证实插入载体PCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列,真核表达重组质粒PCI-Ghrelin-28aa构建成功;以构建的PCI-Ghrelin-28aa质粒肌肉注射(1 mg/kg)昆明小鼠(体重18~20 g),观察其体重变化。结果表明:注射该基因质粒5 d后,实验组小鼠平均日增重高于对照组,且差异显著(P<0.05),尤其是注射10~15 d增重最为明显。本试验构建的PCI-Ghrelin-28aa基因质粒对小鼠具有明显的促生长作用,并将成为新的促猪生长的基因药物。     

新型冠状病毒E基因真核表达载体的构建及表达

囊膜蛋白（E蛋白）是新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2,SARS-CoV-2)的小包膜蛋白,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为了更有利地研究SARS-CoV-2 E蛋白的生物学功能,研究成功构建了SARS-CoV-2 E基因的真核表达载体。首先,通过PCR技术扩增SARS-CoV-2 E基因,并将pCMV-Myc载体进行双酶切。随后,利用同源重组将SARS-CoV-2 E基因连接至pCMV-Myc载体。经酶切和测序鉴定发现,SARS-CoV-2 E基因成功克隆至pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E。将重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E转染至HEK-293T细胞,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测重组质粒的表达以及定位情况。结果表明,重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E在HEK-293T细胞中成功表达,并且发现重组蛋白主要分布于胞质,少量存在于胞核,为进一步研究SARS-CoV-2 E蛋白的功能奠定基础。     

广西巴马小型猪Tau基因可变剪接体的克隆和鉴定

为研究广西巴马小型猪Tau基因可变剪接体序列,根据NCBI中预测的猪Tau基因序列设计引物,利用巢式PCR和5’RACE方法克隆并验证Tau基因.结果显示:广西巴马小型猪Tau基因与参考序列相比存在3处缺失,分别为191～277、344～1 389、1526～1579 bp.3处缺失形成4条Tau基因的可变剪接体,其序列长度分别为1302、1215、1356、1269 bp,提交至GenBank获得登录号分别为KC473498、KC473499、KC473500、KC473501.     

猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。     

猪Annexin A2基因真核表达载体的构建及表达

根据猪的Annexin A2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增Annexin A2基因cDNA,并将其克隆到pGEM-T载体后进行测序分析,然后将测序结果正确的Annexin A2基因cDNA亚克隆到pEGFP-N1表达载体上,成功构建了表达载体.将表达载体瞬时转染Marc-145细胞,结果表明:表达载体pEGFP-N1 -ANXA2可以在Marc-145细胞中表达.     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA克隆及序列分析

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3%、50.9%和49.9%.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.