应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

 本研究建立了葡萄病毒B的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10^-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43% ~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5% ~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31% 和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明, RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。     

葡萄卷叶伴随病毒2实时荧光定量RT-PCR技术的检测应用

通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。     

应用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测柑桔衰退病毒

 根据柑桔衰退病毒(CTV)P20基因序列设计cquctv9/cquctv10特异引物对,以柑桔RNApolymeraseⅡ基因作为内参照,建立了柑桔衰退病的常规RT-PCR快速检测体系;依据柑桔衰退病毒P20基因序列设计cquctv1/cquctv2特异引物对和TaqMan探针cquctvp1,建立了柑桔衰退病荧光定量RT-PCR快速检测体系。常规RT-PCR检测下限是含有CTV的50pg总RNA,荧光定量RT-PCR法的检测下限是2fg纯CTV片段。荧光定量RT-PCR的灵敏度相对比常规RT-PCR高100倍。利用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR体系对从2005年3月到2006年7月采自田间的样品进行检测,结果表明,2种检测体系都有很好的特异性和准确性;对183个田间柑桔苗木样品带毒率检测结果表明,荧光定量RT-PCR检出率为(82.5%),比常规RT-PCR检出率(73.2%)高。     

‘阳光玫瑰’葡萄病毒小RNA测序鉴定及RT-PCR检测

 ‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原,本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定结果显示:显症样品中测定到8种病毒,其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus, GFabV)和灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV);无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测,结果表明:‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高,病毒复合侵染情况普遍;显症样品中,GFabV检出率为88.2%,GPGV和葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)检出率为64.7%和29.4%,均明显高于无症状样品(13.8%和10.3%)。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况,为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。     

‘阳光玫瑰’葡萄病毒小RNA测序鉴定及RT-PCR检测

 ‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原,本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定结果显示:显症样品中测定到8种病毒,其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus, GFabV)和灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV);无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测,结果表明:‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高,病毒复合侵染情况普遍;显症样品中,GFabV检出率为88.2%,GPGV和葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)检出率为64.7%和29.4%,均明显高于无症状样品(13.8%和10.3%)。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况,为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。     

4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测

 葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。     

柑橘黄化脉明病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为探索柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的柑橘新病害—柑橘黄脉病的早期快速检测技术,针对CYVCV核酸结合蛋白基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化退火温度,建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法,并对采自不同柑橘品种的54个CYVCV疑似样品进行了检测。结果表明,CYVCV巢式RT-PCR检测中,以55℃和60℃分别作为第1轮和第2轮扩增的退火温度时检测效果最佳;该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为2.40μg/L,灵敏度较RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似样品检测中,巢式RT-PCR和RT-PCR的阳性检出率分别为59.26%和57.41%,前者更适用于检测不同来源的CYVCV。当尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑嫁接接种CYVCV后,巢式RT-PCR比RT-PCR提前10~30 d检测出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法适用于田间病树的早期诊断。     

葡萄卷叶伴随病毒1号和3号宁夏分离物部分基因序列分析

为明确葡萄卷叶伴随病毒(GLRaVs)在宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄上的侵染状况,采用RT-PCR技术对40份酿酒葡萄样品中的GLRaV-1~GLRaV-5进行了外壳蛋白(CP)、复制酶(RdRp)和热激蛋白(HSP70)基因序列的克隆和分析。检测结果表明,在所检测的5种病毒中,除GLRaV-2和GLRaV-4未检测到外,GLRaV-1和GLRaV-3的检出率最高,分别为20.0%和32.5%,GLRaV-5的检出率仅为5.0%;有6个样品存在GLRaV-1和GLRaV-3两种病毒复合侵染。序列分析表明,GLRaV-1宁夏分离物的部分CP基因序列长度为232nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为90%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的CP基因序列长度为942nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为40%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为40%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的RdRp基因序列长度为683nt,其各分离物间的核苷酸序列同源率为90%以上,与已报道的国内外其他分离物RdRp基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的HSP70基因序列长度为546nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为96%,与已报道的国内外其他分离物HSP70基因序列相比,其同源率为96%~99%。     

葡萄卷叶伴随病毒2号和3号辽宁分离物部分基因组的序列分析

 将采自辽宁兴城地区在生长期间具典型卷叶病症状的金星无核(Venus Seedless)葡萄品种休眠枝条,用RT-PCR检测4种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated viruses,GLRaVs),扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)和葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)两种病毒的主要外壳蛋白(major coat protein,CP)基因的完整序列(GenBank登录号分别为FJ786017和FJ786016)。这表明该葡萄植株受到了GLRaV-2和GLRaV-3辽宁分离物(GLRaV-2-LN和GLRaV-3-LN)的复合侵染。根据检测结果,克隆了GLRaV-2-LN基因组3'端CPm (minor capsid protein)、p19(19-kDa protein)和p24(24-kDa protein)基因(GenBank登录号分别为FJ786018、FJ786019和FJ786018)。序列分析表明,GLRaV-3-LN的CP基因全长942 nt,与已报道的国内外其它分离物CP基因全序列相比,核苷酸序列同源性为89.8%~91.8%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.9%~97.4%。GLRaV-2-LN的CP、CPm、p19和p24基因全长分别为597 nt、672 nt、486 nt和618 nt。与国外报道的几个分离物的相应蛋白基因全序列相比,核苷酸序列同源性分别为88.3%~100.0%、78.7%~99.9%、75.1%~99.4%和87.5%~99.5%;由此推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100.0%、89.2%~100.0%、73.9%~99.4%和89.3%~99.0%。     

我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析

为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）的感染情况及病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因的变异特点,从而为其致病性、病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCR检测,根据地区与品种差异选取了24个阳性样品进行cp基因克隆与测序分析,并对不同RNA提取方法进行了比较。结果显示,114株样品被GRSPaV侵染,平均带毒株率为37.4%;分离物间及同一分离物不同克隆间的序列差异较大,从24个分离物克隆获得的37条cp基因序列与来源于不同国家的12个GRSPaV分离物的核苷酸序列同源性为80.5%~99.7%,氨基酸序列同源性为88.8%~100%;各个分离物的遗传距离无明显地域差异;SiO₂吸附法比SDS法和CTAB法更适宜葡萄样品RNA的提取。     

猕猴桃植株中柑橘叶斑驳病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)在陕西省栽培猕猴桃中发生普遍。为监测CLBV发生情况,本研究建立了CLBV的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。该方法特异性强,可准确检测目的病毒,标准曲线斜率为-3.378,决定系数R²=0.997 9,扩增效率为97.7%,比普通RT-PCR灵敏度高100倍,可用于猕猴桃植株CLBV的批量检测或低丰度病毒样本(如猕猴桃休眠枝条)的检测。为苗木携带CLBV病毒的早期诊断、果园病毒病预测预报和防控奠定了基础。     

应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%~15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

利用RT-PCR方法检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒

通过设计特异性引物SQCPF/SQCPR,扩增南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)CP基因的保守序列,进行RT-PCR,对扩增得到的特异性片段进行序列测定,测序结果显示扩增产物序列与GenBank中登录的SqMV外壳蛋白基因存在87%～96%的一致性;建立了适用于检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒的RT-PCR结合ELISA方法,通过在酶联板的反应孔中直接进行反转录合成cDNA,能扩增到预期大小的DNA条带,且检测灵敏度高于DAS-ELISA方法10倍以上。用建立的RT-PCR结合ELISA方法检测进境甜瓜种子携带的SqMV,在42份样品中检出4份阳性样品。     

马铃薯块茎和土壤样品中粉痂病菌快速检测方法的建立

 马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea f. sp. subterranea)是引起马铃薯粉痂病的病原。本研究根据粉痂菌内部转录间隔区和线粒体DNA的保守区域,分别设计了2对适用于普通PCR的引物A5/A9、C3/C8和1对适用于荧光定量PCR的引物QF/QR,用于检测块茎和土壤样品中的粉痂菌。特异性检测结果表明:引物对A5/A9和C3/C8,以马铃薯粉痂菌DNA为模板,能分别扩增出264和367 bp大小的单一条带,而对其他非靶标DNA无扩增;引物对QF/QR对马铃薯粉痂菌有单一的熔解峰,说明三对引物特异性良好。灵敏性检测结果表明:荧光定量PCR灵敏度为13.8 fg·μL^-1,是普通PCR灵敏度的1 000倍。进一步建立循环域值(Ct)与质粒DNA含量的曲线关系,获得标准曲线y=-3.893 9 x+35.228,R² = 0.9966,呈良好线性关系。通过对不同地区采集的18份带菌种薯和18份带菌土壤进行普通PCR和荧光定量PCR检测,引物A5/A9、C3/C8和QF/QR对带菌种薯检测率均为100%,对带菌土壤的检测率分别为44.44%、66.67%和100%。本研究建立的马铃薯粉痂病菌快速检测方法,能及时、准确地检测带菌种薯和土壤,为马铃薯粉痂病的早期诊断和防治提供依据。     

番茄褐色皱果病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)外壳蛋白(coat protein,CP)的保守基因序列设计l对特异性引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒...