维药阿魏根多糖体外抗新城疫病毒的作用

用水提醇沉法得到阿魏根总多糖FSPt和4种分级多糖FSP_(30)、FSP_(50)、FSP_(70),FSP_(80)用苯酚-硫酸法及红外光谱对阿魏根多糖进行检测。用MTT法测定各多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,选择安全浓度范围内5种浓度的各多糖与新城疫病毒(NDV)用3种不同的加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加入到鸡胚成纤维细胞(CEF)中,用MTT法测定各多糖对NDV感染CEF能力的影响。先加多糖后接病毒组和先接病毒后加多糖组FSP_(30)、FSP_(50)、FSP_(70)和FSPt均能显著抑制NDV感染CEF;多糖与病毒感作后加组FSP_(70)和FSP_(80)有显著抑制NDV感染CEF的作用(P0.05)。结论:新疆阿魏根多糖具有较好的抗NDV作用,其中FSP_(30)和FSP_(50)对病毒的抑制率较高,FSP_(70)在3种加药方式中均表现出显著且稳定的抗NDV作用,综合考虑,FSP_(50)具有很好的研发前景。     

朱砂七提取物体外抑菌和抗病毒活性部位筛选

为筛选朱砂七提取物体外抑制9株临床分离致病菌和抑制新城疫病毒(NDV)的活性部位,采用琼脂扩散和试管稀释法进行体外抑菌试验,MTT法和鸡胚法测定了朱砂七提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚内增殖的影响.结果显示,朱砂七乙酸乙酯部位(PCE)对9株临床分离菌的MBC均小于100 g/L;朱砂七氯仿部位(PCC)有一定的抑菌作用;大黄素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的MBC分别为5,2.5,2.5,2.5,1.25 g/L;PCE进一步分离部位PCEA对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的MBC分别为24,24,12,6,6 g/L.PCC和大黄素对NDV在CEF上增殖的抑制作用不明显;PCE对NDV在CEF上的抑制率为39.12%(P＜0.01),PCEA对NDV在CEF上的抑制率为72.33%(P＜0.01);PCEA对NDV在鸡胚中增殖具有抑制作用,其预防组和药毒混合组与病毒对照组的血凝效价差异显著(P＜0.05),而治疗组与病毒对照组差异不显著.由此可知,朱砂七提取物具有抑制细菌作用,PCE和PCEA对NDV的增殖具有一定的抑制作用.     

中药牛皮消多糖体外抗新城疫病毒作用的研究

为探讨牛皮消多糖(CAP)对体外抗新城疫病毒(NDV)能力的影响,本试验用水提醇沉法提取牛皮消多糖,通过苯酚硫酸法和红外光谱对牛皮消多糖进行检测,采用MTT法测定牛皮消多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,多糖的安全浓度统一为625μg/mL,选择安全浓度范围内的(39.06～625μg/mL)5种浓度的各级多糖,用3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加药)检测牛皮消多糖对NDV的阻断、抑制及直接杀灭作用。结果显示,先接病毒后加多糖组和多糖与病毒感作后加药组CAP_(50)、CAP_(30)、CAP_t、CAP_(80)和CAP_(70)均能显著抑制NDV感染CEF的能力,两组各级多糖抑制率分别为131.23%、110.12%、108.15%、100.24%、93.07%和61.76%、43.73%、44.51%、29.02%、37.45%;先加多糖后接病毒组CAP_(50)、CAP_(30)能显著抑制NDV感染CEF的作用(P0.05),阻断作用下对NDV的抑制率可达到15.82%、8.33%,其余各组在安全浓度范围内对NDV无抑制作用。各组中药牛皮消多糖均有较好的抗NDV活性,其中对NDV的抑制作用和直接杀灭作用强于对其阻断作用。CAP_(50)及CAP_(30)的抗NDV活性较强,可作为进一步研究材料并具备一定的研究价值。     

麦冬多糖对鸡新城疫病毒作用的体外研究

为探究麦冬多糖对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的作用,试验采考马斯亮兰G-250法分别测定提取物的糖和蛋白含量,用MTT法测定不同分子量麦冬多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,用3种作用方式测定麦冬多糖对NDV的作用效果及机制。结果显示:麦冬多糖对CEF的安全浓度为78.125μg/mL;OPS_(80)在3种作用方式中的病毒抑制率分别为37.36%、29.63%、39.30%,均高于其余4种。研究表明,各麦冬多糖均有明显的抗NDV活性,其中OPS_(80)的活性最好,作用机制最可能为杀灭和阻断作用。     

流感病毒NA基因的亚细胞定位及抗病毒活性研究

本研究利用神经氨酸酶(Neuramidinase,NA)可诱导机体产生特异性抗体,抑制流感病毒从已感染的细胞释放减少病毒增殖的特点,探索NA基因用于研制抗病转基因家禽的新思路.通过构建NA基因真核表达载体pcDNA3.0-NA和pcDNA3.0/EGFP-NA,转染NIH 3T3细胞后对NA基因进行亚细胞定位研究;用pcDNA3.0-NA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),接种新城疫病毒(NDV)后观察CEF细胞形态,研究NA基因抗病毒能力;用pcDNA3.0-NA转染NIH 3T3细胞后提取细胞裂解液,纯化NA蛋白,以不同浓度倍比稀释后,加至铺满单层CEF细胞的96孔板,37℃孵育24h,弃去上清,接种NDV,采用微量细胞病变抑制法研究NA基因的抗病毒活性;间接免疫荧光试验和EGFP融合表达结果显示,NA蛋白定位于细胞质;NDV-CEF细胞病变抑制试验表明重组的NA蛋白具有较强的抗NDV生物活性.     

中草药在鸡胚成纤维细胞(CEF)上对新城疫病毒的作用研究

分离并培养鸡胚成纤维细胞(CEF),并感染新城疫病毒(NDV),通过观察细胞病变,检测在CEF上,复方中草药对NDV的影响。结果表明,中草药对新城疫病毒的中和、预防、治疗作用的最小抗病毒浓度分别是0.061mg/ml、0.244mg/ml、0.976mg/ml。     

玉屏风多糖体外抗新城疫病毒效果的研究

以新城疫病毒(NDV)感染鸡胚和鸡胚成纤维细胞,探索玉屏风多糖(Yupingfeng polysaccharides YPF-P)及其含药血清的抗病毒效果。SPF兔采用500 mg/kg体重YPF-P灌服给药,于第1、3、5、7天采集全血,制备不同浓度含药血清;培养SPF鸡成纤维细胞(CEF),分别加入不同浓度的YPF-P及其含药血清,进行细胞毒性试验;采用先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同时加入的3种给药方式,观察YPF-P及其含药血清对病毒的阻断、抑制和直接杀灭作用。结果与正常对照组相比,不同浓度YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/m L)和7 d的YPF-P含药血清的CEF细胞活性均显著增强(P<0.05或P<0.01)。CEF培养24 h后,YPF-P抑制病毒作用明显,与NDV对照组相比差异极显著(P<0.01);3种给药方式与NDV对照组相比,含药血清组细胞活性均极显著升高(P<0.01)。表明YPF-P及其含药血清均对CEF无毒副作用,且可显著增强细胞活性;YPF-P及其含药血清有较好的抑制病毒毒性的作用。     

芩花口服液抗鸡新城疫病毒体外研究

为研发抗新城疫病毒(NDV)新药,将黄芩、金银花、前胡、甘草等中药制成的芩花口服液稀释至安全范围浓度,在鸡胚成纤维细胞(CEF)培养系统中进行抗NDV感染试验.用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化.结果显示:先加芩花口服液后接种NDV、先接种NDV后加芩花口服液、芩花口服液和NDV同时加入,芩花口服液浓度为0.0625、0.125、0.25、0.50、1.0、2.0 mg/mL时均有显著抗NDV感染CEF作用.此试验初步为寻求抗NDV药物提供一条新途径.     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。     

“芪蓝饮”及不同提取成分对NDV在鸡胚成纤维细胞中增殖的影响

为评价新兽药"芪蓝饮"及其不同提取成分的体外抗病毒活性,本试验通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测了各提取成分对新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程的影响。结果显示,在3种加药方式中"芪蓝饮"原药(QLY)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为128.85%;原药总多糖(TPS)干扰NDV的增殖作用最强,其抑制率最高为130.23%;原药总萜类(TT)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为146.15%;板蓝根总生物碱(RIA)及其水溶性部位(RIAw)和酸性部位(RIAa)对抗NDV的方式是多环节的。综上所述,"芪蓝饮"及其提取成分表现出较强的干扰NDV增殖和直接杀灭NDV的作用,而阻断作用稍弱。     

蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响

本试验旨在研究蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响。首先采用MTT法测定蜂胶黄酮对宿主鸡胚成纤维细胞（CEF）和PK-15细胞的安全浓度;然后将蜂胶黄酮从最大安全浓度250 μg/mL开始倍比稀释至15.6 μg/mL共5个浓度,将蜂胶黄酮分别与新城疫病毒（NDV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪细小病毒（PPV）一起加到相应长成单层的宿主细胞CEF或PK-15中,在感染后24、48和72 h分别用MTT法测定宿主细胞的存活率,代表蜂胶黄酮提高宿主细胞抗病毒能力的指标。结果显示,蜂胶黄酮可显著提高宿主细胞抗病毒能力,这种活性与其剂量正相关,即剂量越大作用越好。蜂胶黄酮提高宿主细胞抗有囊膜病毒NDV和TGEV作用主要体现在病毒感染的前期,而提高宿主细胞抗无囊膜病毒IBDV和PPV作用主要体现在病毒感染的后期。提示蜂胶黄酮可用于NDV和TGEV的预防及IBDV和PPV的治疗。     

列当多糖对鸡新城疫病毒在鸡成纤维细胞中增殖的抑制作用

为研究列当多糖抗新城疫病毒(NDV)活性,用水提醇沉法提取列当总多糖及4种分级多糖,并通过苯酚硫酸法及红外光谱对列当多糖进行检测。通过MTT法测定各级多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度。以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加药,检测列当多糖对新城疫病毒的阻断作用、抑制作用及直接杀灭作用。结果表明,列当总多糖及4种分级多糖均具有抗NDV活性,其中对NDV的抑制作用及阻断作用强于对NDV的直接杀灭作用。50%、80%梯度醇沉的列当多糖(OSP50、OSP80)及总多糖(OSPt),阻断作用下的病毒抑制率分别为19.50%、33.10%和22.30%,抑制作用下的病毒抑制率分别为19.00%、21.90%和22.60%,杀灭作用下对NDV的抑制率分别为,14.70%、17.50%和13.30%,其余各组多糖阻断作用、抑制作用及杀灭作用下的病毒抑制率均低于上述3组多糖。说明OSP50、OSP80及OSPt的抗NDV活性较好,可以作为进一步研究的材料。     

利用RNAi技术靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制

构建了针对新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi质粒;转染质粒36 h后接种NDV,通过对病毒滴度测定、实时荧光定量PCR和细胞病变结果分析,表明其能抑制NDV在CEF中的复制和增殖.本试验为进一步研究NDV复制机理和抗病毒治疗提供了技术基础.     

中药牛皮消多糖体外抗新城疫病毒作用的研究

为探讨牛皮消多糖（CAP）对体外抗新城疫病毒（NDV）能力的影响，本试验用水提醇沉法提取牛皮消多糖，通过苯酚硫酸法和红外光谱对牛皮消多糖进行检测，采用MTT法测定牛皮消多糖对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度，多糖的安全浓度统一为625 μg/mL，选择安全浓度范围内的（39.06~625 μg/mL）5种浓度的各级多糖，用3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加药）检测牛皮消多糖对NDV的阻断、抑制及直接杀灭作用。结果显示，先接病毒后加多糖组和多糖与病毒感作后加药组CAP₅₀、CAP₃₀、CAP_t、CAP₈₀和CAP₇₀均能显著抑制NDV感染CEF的能力，两组各级多糖抑制率分别为131.23%、110.12%、108.15%、100.24%、93.07%和61.76%、43.73%、44.51%、29.02%、37.45%；先加多糖后接病毒组CAP₅₀、CAP₃₀能显著抑制NDV感染CEF的作用（P<0.05），阻断作用下对NDV的抑制率可达到15.82%、8.33%，其余各组在安全浓度范围内对NDV无抑制作用。各组中药牛皮消多糖均有较好的抗NDV活性，其中对NDV的抑制作用和直接杀灭作用强于对其阻断作用。CAP₅₀及CAP₃₀的抗NDV活性较强，可作为进一步研究材料并具备一定的研究价值。     

RNAi靶向NP、L基因抑制鹅源副黏病毒在鸡胚成纤维细胞中的复制

构建了针对鹅源副黏病毒(GPMV)NA-1株NP及L基因的RNA干扰质粒;将转染质粒36 h后的鸡胚成纤维细胞接种病毒,通过病毒滴度、实时荧光定量RT-PCR、细胞病变以及间接免疫荧光结果分析,表明均能抑制GPMV在CEF中复制和增殖.本试验对研究GPMV复制和抗病毒治疗提供了技术基础.     

黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对NDV血凝性的影响

采用微量血凝法 ,测定了黄芪多糖 (APS)、淫羊藿多糖 (EPS)、淫羊藿总黄酮 (EF)对NDV血凝性的影响。结果表明 ,APS、EPS、EF能显著提高NDV的血凝效价 ,且与浓度有相关性 ,EPS并能延长NDV的血凝时间 ,将它们与混合病毒感作后 ,这种作用消失。     

12种藏药对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响

为筛选抗新城疫病毒藏药复方的组分药,将安全质量浓度范围内的藏菖蒲、红景天、灵芝菌柄、灵芝菌盖、决明子、天冬、龙胆、降香、乳香、仁青芒觉、二十五味松石丸、二十五味珍珠丸的煎液和鸡新城疫病毒(NDV)分别以3种方式(先加藏药后接种病毒、先接种病毒后加藏药、藏药和病毒感作后同时加)加入到鸡胚成纤维细胞(CEF)的培养体系中.用MTT法测定各藏药对NDV感染CEF能力的影响.结果表明:多数藏药均能显著抑制NDV感染细胞,且与加药方式和药物质量浓度有一定关系.藏菖蒲、灵芝菌盖和降香在3种加药方式中均呈现显著效果,可作为抗NDV藏药复方的组分药.     

芦荟粗提物抑菌及抗病毒作用的研究

为研究芦荟粗提物对多种常见畜禽致病菌和病毒的体外抑菌和抗病毒作用,本实验采用培养基打孔法观察芦荟粗提物对致病菌的抑茵作用;采用含不同浓度芦荟粗提物的固体培养基培养致病菌观察其抑茵效果;采用细菌计数法分析致病茵在芦荟粗提物液体培养基中的增殖情况.分别采用细胞培养和鸡胚接种法检测不同浓度芦荟粗提物以及不同作用时间对传染性囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)增殖的抑制作用.结果表明:芦荟粗提物对供试茵均具有抑茵作用,其中金黄色葡萄球菌、四联球菌、八叠球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌培养时出现明显的抑茵圈,直径(D)＞14 mm;固体培养基中芦荟粗提物浓度大于40％时可形成可明显地减少茵落数;浓度大于80％的液体培养基中细菌生长到达对数期的时间比对照组延长至少4h.IBDV与芦荟粗提物作用组的MTT OD570nm值均高于病毒对照组,并且随浓度的增大和时间的延长而升高;NDV与芦荟粗提物作用组的血凝价均低于病毒对照组,并且随浓度的增大和作用时间的延长而降低.     

神经氨酸酶基因联合抗黏液病毒基因的抗病毒作用

拟构建神经氨酸酶(NA)基因和抗黏液病毒(Mx)基因双基因真核共表达载体,并检测基因表达以及转染鸡成纤维(CEF)细胞后的抗病毒效果。克隆了NA基因和突变型Mx基因的cDNA;分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2中,酶切和测序鉴定双基因共表达载体pVITRO2-Mx-NA的正确性。用pVITRO2-Mx-NA转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)方法检测目的基因的表达。随后用pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞,利用RT-PCR及微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒(NDV)的效果。结果:酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体pVITRO2-Mx-NA,在转染后的NIH-3T3和CEF细胞中同时检测到了NA和Mx基因的表达。联合基因表达的重组蛋白可保护CEF细胞在孵育的72h内免受NDV的感染,而转染了突变型Mx或者NA单基因真核表达载体的CEF细胞在孵育的48h内亦未受到NDV的侵染;与单基因转染组相比,联合基因转染组明显延迟NDV感染CEF细胞的时间,差异显著(P<0.05)。构建的双基因真核表达载体pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞后,其表达的重组蛋白Mx-NA在细胞水平上具有协同延缓NDV感染的能力,且优于单个基因。     

靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

为验证腺病毒载体在鸡胚成纤维细胞(CEF)及鸡胚中递送小干扰RNA的可行性,本实验利用共转染技术将表达针对新城疫病毒(NDV)NP基因shRNA的重组质粒同源重组到pGSadeno腺病毒载体系统,用重组腺病毒感染CEF和鸡胚,通过红荧光报告基因的表达情况和荧光定量PCR检测NP基因mRNA的表达对其进行鉴定,并通过细胞形态观察、血凝价的测定评价其在CEF和鸡胚上对NDV增殖的影响。实验结果显示重组腺病毒能够感染CEF,感染CEF后6h、9h、12h与对照组比较NP基因mRNA的表达量分别降低了3.2倍,25.6倍,2.57倍,并能够推迟NDV致细胞病变效应,抑制NDV在鸡胚上的增殖,延缓鸡胚的死亡。本实验构建的重组腺病毒能够在CEF和鸡胚上递送特异的shRNA,为在CEF中的RNA干涉研究开辟了新的递送途径。