鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性分析

为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18（inteleukin 18,IL-18）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）基因序列,克隆白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因并进行序列分析。结果显示：白来杭鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸,所获得的白来杭鸡IL-18基因与GenBank鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%。白来杭鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸,所获得的白来杭鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%-100%。IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性。IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点及3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点及4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果为进一步研究鸡IL-18、GM-CSF基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

杂交猪白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18(IL-18)全基因的cDNA,其大小为579bp,编码192个氨基酸。与GenBank上已发表猪IL-18序列(ABO10003)进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处(以ATG为1计)由A→G,存在有意义突变。与GenBank上的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%,98.5%,99.8%和99%。从系统进化树可以看出,河南良杂猪IL-18基因与ABO10003、AY262109亲缘关系最近。河南良杂猪IL-18基因和人及其他动物IL-18基因核苷酸序列进行比较分析,结果显示猪与人、猫、牛、鸡、鸭、海豚、山羊、马、家鼠、老鼠、绵羊的IL-18基因核苷酸同源性分别为83.1%、88.3%、90.7%、26.8%、31.4%、26.3%、90.0%、91.5%、67.7%、65.1%和90.8%。     

编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定

白细胞介素18（IL-18）是一种能诱导IFN-γ产生的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用，本研究根据已发表的鸡白介素18（IL-18）cDNA基因序列设计引物，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从有丝分裂原ConA刺激48小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白质的基因。并进行序列测定。并与结果进行了比较。发现本研究克隆到的鸡IL-18成熟蛋白编码基因序列在482位为C，而Schnieder等报道的序列为T，这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸。该处碱基变化的原因究竟是鸡 IL-18本身存在多态性，还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致，该处碱基的变化对于鸡IL-18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中，该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL-18基因，为进一步体外表达鸡IL-18蛋白并深入研究其功能奠定了基础。     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

荣昌猪白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6(PIL-6)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(ConA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上,经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明:该基因cDNA全长741 bp,开放阅读框由639个核苷酸组成,推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现:荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高,为99.8%~100%,氨基酸的同源性为99.5%~100%。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

固始鸭白细胞介素-18全基因克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭IL-18cDNA基因序列设计、合成一对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如PHA等刺激脾淋巴细胞,直接提取脾淋巴细胞总RNA,扩增固始鸭IL-18基因,并克隆、测序。测序结果表明固始鸭IL-18基因全序列为610bp,包含1个完整阅读框,编码1条由200个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,固始鸭IL-18基因与GenBank中两条鸭IL-18基因(AF336122和DQ490137)核苷酸同源性分别为98.8%、99.8%,与AF336122有5个碱基发生非同义变异,2个碱基为同义变异,氨基酸同源性为97.5%,与DQ490137有一个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%。固始鸭IL-18前体蛋白第30位谷氨酸处有一个IL-1β转换酶的caspase-1切割位点及在人和其他动物中已证实的IL-1标签序列,推测鸭IL-18成熟蛋白由170个氨基酸组成。固始鸭与人和其他动物的IL-18基因进化分析表明,IL-18基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。     

猪ICOS基因部分cDNA的克隆与序列分析

研究旨在对猪T细胞诱导型刺激物(ICOS)基因的cDNA序列进行克隆与分析。根据已报道的人ICOS基因cDNA序列设计引物,首次从猪脾脏组织总RNA中扩增出ICOS基因编码区全长cDNA序列,克隆于pMD18-T载体后进行测序并进行序列拼接,运用生物信息学分析DNA序列。结果表明:该基因编码区全长630bp,编码210个氨基酸,包含5个外显子。该序列与人全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为80%和85%;与狗和小鼠的推导氨基酸序列的同源性分别为81%和75%。这为进一步研究该基因的结构特点和功能奠定了良好基础。     

广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。     

犬脾细胞白介素-18(IL-18)基因的克隆与序列分析

为了研究白细胞介素-18(IL-18)的活性和功能，将犬脾细胞经ConA诱导，用TRIzol裂解，提取总RNA，通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出犬IL-18的cDNA，然后连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，获得阳性重组质粒。核苷酸序列结果表明，我们得到了长686bp的基因，含有一个582bp的开放阅读框架，编码193个氨基酸。与已知犬序列同源性可高达99．6％，与已知猪序列的同源性为89．8％，所克隆基因为今后进一步研究IL-18基因的功能奠定了基础。     

鹅bcl-2基因部分cDNA的克隆与序列分析

细胞凋亡是基因活动引起的级联反应的结果。现已发现大约有30多种分子专门参与细胞凋亡调控，其中bcl-2家族是一类主要的细胞内调控物质，由相应的bcl-2基因家族编码。自Tsujimoto等首先克隆人bcl-2基因以来，随后的一系列研究发现bcl-2蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡、延长细胞寿命，这些研究主要集中于人、     

牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析

克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。     

狂犬病鼠源野毒M株核蛋白基因的克隆及序列分析

从感染狂犬病的鼠脑中快速提取细胞总RNA，用RT—PCR方法得到编码核蛋白完整结构基因的cDNA，进一步将此基因克隆入pGEM—T中，进行核苷酸序列的测定，并推导出氨基酸序列，将这一序列与国内外已发表的9株狂犬病病毒的NP全基因进行比较分析。结果表明狂犬病鼠源野毒M株与上述9株的同源性在71．0％～99、8％之间，氨基酸同源性在77．6％～99．6％之间，M株与CVS株无论核苷酸序列还是氨基酸序列同源性都最高，分别为99．8％和99．6％，而与CTN珠的核苷酸序列同源性较低，与Mokola株的核苷酸序列以及氨基酸序列同源性都最低，分别为71．0％和77．6％。本研究为进行狂犬病病毒的分子流行病学调查和研制狂犬病基因工程苗提供了理论依据。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达

根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

籽鹅促卵泡激素α亚基基因的克隆、序列分析及其原核表达载体的构建

以雌性籽鹅脑垂体的总RNA为模板,利用特异性引物通过RT-PCR扩增获得长为363 bp的籽鹅促卵泡激素α亚基的cDNA片段,将扩增的促卵泡激素α亚基基因片段克隆至pMD18-T载体后进行测序。将测序结果与鸡、鹌鹑、火鸡、鼠、羊、牛等多种禽类和哺乳动物的该基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,这些物种促卵泡激素α亚基基因序列具有较高的保守性,其中与鸡、鹌鹑、火鸡的核苷酸同源性最高,均为95.9%,推导的氨基酸序列与鸡、鹌鹑、火鸡的同源性最高,均为97.5%。为了对克隆的籽鹅促卵泡激素α亚基基因功能研究提供基础,将籽鹅促卵泡激素α亚基基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体。     

延边黄牛白细胞介素18基因的克隆及序列分析

本试验旨在扩增延边黄牛白细胞介素18(IL-18)全长cDNA,并对其序列进行进化分析。根据GenBank中已公布的牛IL-18 cDNA序列设计1对引物,利用RT-PCR从刀豆蛋白(ConA)和植物分裂素(PHA)双重刺激36 h活化的延边黄牛脾淋巴细胞中扩增出牛IL-18全长cDNA,进行PCR、酶切和测序鉴定,并做进化分析及二级结构预测。扩增出延边黄牛IL-18全长cDNA,大小为760 bp,其中有两个氨基酸突变。进化分析结果显示,延边黄牛IL-18与牛、山羊、绵羊、马和猪的同源性较高,均大于90%,与同种群牛的同源性最高,而与原鸡的同源性最低,为51.1%。本研究确定了IL-18的种群差异,并预测了二级结构特性,为进一步研究延边黄牛IL-18的基因表达、生物活性及其作为佐剂的应用奠定了基础。