广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

11株新城疫病毒广西分离株P基因的克隆和序列分析

根据基因库的新城疫病毒(NDV)的磷蛋白(P)基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对11个NDV广西分离株的P基因进行RT-PCR扩增和序列测定,P基因阅读框的核苷酸序列全长均为1188bp,编码395个氨基酸。核苷酸及氨基酸全序列比较分析,结果表明:11个NDV广西分离株与10个参考株的核苷酸序列同源性为81.2%～97.8%,氨基酸同源性为78.8%～97.0%。     

11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析

根据基因库中新城疫病毒(NDV)的NP基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的11株NDV毒株NP基因进行RT-PCR扩增和序列测定,拼接出11个NDV广西分离株的NP基因的全序列,10个NDV广西分离株的NP基因阅读框的核苷酸序列全长均为1470 bp,编码489个氨基酸,它们的NP基因核苷酸全序列及推导的氨基酸全序列与10个已发表的NDV参考株的NP基因全序列比较分析结果表明:核苷酸序列同源性为84.8%～98.2%,氨基酸同源性为89.8%～99.4%.     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序.测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间.     

白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18（inteleukin 18,IL-18）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）基因序列,克隆白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因并进行序列分析。结果显示：白来杭鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸,所获得的白来杭鸡IL-18基因与GenBank鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%。白来杭鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸,所获得的白来杭鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%-100%。IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性。IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点及3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点及4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果为进一步研究鸡IL-18、GM-CSF基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

鸭A-FABP基因的克隆及其组织表达

本文采用RT-PCR方法从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了A-FABP基因的cDNA序列,其长度为422 bp,包含了1个399 bp的完整CDS,编码132个氨基酸。该序列与家禽（鹅、鸡）和哺乳动物（人、小鼠、猪、牛）的A-FABP基因序列约有94%和73.4%-75.7%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性为92.4%和72.0%-77.3%。半定量RT-PCR研究结果为A-FABP基因在间脑、肺和肾组织中不表达,在脂肪组织中的表达明显高于其他组织（P〈0.5）。表明A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因的表达具有组织特异性。     

鸡IL—15基因的分子克隆及其有关特性的研究

实验应用聚合酶链式反应技术从鸡脾淋巴细胞中克隆得到了白细胞介素-15基因，序列分析表明与已发表的鸡白细胞介素-15基因完全一致，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与牛的最接近，同源性分别为46%和31%，与哺乳动物白细胞介素-15序列类似，有4个高度保守的半胱氨酸残基，同时本研究也用此方法对鸡脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺和盲肠扁桃体等淋巴器官的淋巴细胞中鸡白细胞介素-15mRNA的表达进行了研究，结果表明这些器官的淋巴细胞均表达mRNA。在实验还用有丝分裂原ConA对鸡脾淋巴细胞进行活化，观察活化的淋巴细胞表达白细胞介素-15mRNA的情况，结果发现白细胞介素-15mRNA在活化的脾淋巴细胞中表达量升高。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。     

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物，以犬贾第虫（长春株）纯培养滋养体总核酸为模板进行RT—PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序，通过BLAST在GenBank进行同源性搜索，并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒（长春株）基因组全长为6276bp（DQ238861），编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1056个氨基酸残基的融合蛋白，这2个阅读框被-1核糖体移码框分开，重叠处有220nt。基因组中G＋C占49．62％。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒（L13218）序列同源性为94．62％，编码的氨基酸同源性为93．50％；与国内人源蓝氏贾第虫病毒（AF525216）序列同源性为98．88％，编码的氨基酸同源性为98．30％。     

鸡α-干扰素基因的克隆与序列分析

试验采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鸡脾淋巴细胞中扩增出鸡的α干扰素(ChIFN-α)基因,将包括ChIFN-α编码区的cDNA片段克隆到pMD 18-T载体中,并对该片段进行序列测定,序列分析表明克隆的ChIFN-α基因的开放阅读框(ORF)为582bp,与GenBank内已发表的ChIFN-α序列进行对比,同源性高达98.6%～99.8%。进一步分析各国家和地区上传至GenBank的ChIFN-α基因发现,ORF和编码的氨基酸长度一致,未见地域变化特征。     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

鸡肾型IBV分离株M基因的克隆与特性分析

依据NCBI所登录的鸡传染性支气管炎病毒的M基因序列设计了一对引物,应用TRIzol试剂盒对8个肾型鸡传染性支气管炎病毒陕西地方分离株进行总RNA的提取,以所得到的RNA为模板,用RT-PCR对M基因进行扩增;其目的条带回收提纯后,与PMD18-T克隆载体进行连接,转化到DH5α宿主菌,并经药物抗性筛选、PCR及酶切鉴定,将所筛选鉴定出的阳性质粒进行测序,最后对测序结果进行分析。结果表明：陕西地方8个毒株（BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG）M基因长约为650 bp,其中YX、WH株本身无BamH 1酶切位点。WH与其它分离株的核苷酸同源性为91.8%～92.6%,而其它的分离株间的同源性为98.8%～99.8%。8个毒株与参考株的核苷酸同源性为74.9%～99.8%。其N端90 aa肽段与对照株相比,不同之处表现为高亲水性氨基酸取代低亲水性氨基酸,这会使其具有更好的抗原性。     

3株新城疫山东分离株HN基因全序列测定和分析

用设计的特异性引物,通过RT-PCR法对1999和2004年间分离自山东省的具有一定代表性的3株鸡新城疫病毒(ShD-2-04,ShD-3-99,ShD-5-04)进行HN基因的扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明:3个毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为1716bp,编码571个氨基酸,属强毒的C群;3株山东分离毒的核苷酸同源性为98.2%~98.8%,氨基酸同源性为98.4%~98.8%,其中ShD-2-04和ShD-5-04核苷酸及氨基酸同源性均为最高,达到99.8%和99.8%;将3株山东分离毒株与国内外标准强毒株及弱毒株的HN基因核苷酸及氨基酸同源性分别进行比较:3毒株与国内外标准毒株HN的核苷酸同源性为82.7%~87.2%,氨基酸同源性为87.6%~90.0%,表明已发生一定的变异。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。