产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。     

大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定

采用PCR技术，从大肠杆菌K99中扩增出0．54kb的K99菌毛抗原基因，然后将其克隆到pUCm—T载体上，用Bgl Ⅱ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，通过T4连接酶与同样经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切合成的耐热肠毒素ST Ⅰ核苷酸序列连接，通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析，证明插入的K99-ST Ⅰ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。     

大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析

以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别.     

大肠杆菌不耐热肠毒素LTB大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的构建及表达

为了获取大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,试验以产肠毒素大肠杆菌的大质粒为模板,采用PCR技术扩增大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,并将PCR产物克隆至p MD18-T载体中构建克隆质粒p MD18T-LTB;通过酶切、纯化将LTB基因与大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体p W425et连接构建成重组质粒p W425et-LTB,将p W425et-LTB转化至thy A基因缺陷型大肠杆菌X13感受态细胞中,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明:重组大肠杆菌表达出LTB蛋白,且表达的融合蛋白能被LTB特异性抗体识别。     

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型蛋白的表达研究

为了研究金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型的检测方法,诱导融合表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ型蛋白,试验根据Gen Bank中SEⅠ的序列设计一对特异性引物,采用PCR技术从金黄色葡萄球菌中扩增出新型肠毒素Ⅰ型基因,亚克隆入p EASY-E1载体中,构建重组质粒p EASY-E1-SEⅠ,以IPTG诱导表达,镍柱纯化表达蛋白,用His标签单克隆抗体进行免疫印迹分析验证融合蛋白的表达。结果表明:成功扩增出SEⅠ基因,片段大小为507 bp,重组质粒高效表达SEⅠ融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定成功表达了分子质量约为26 ku的重组蛋白,Western-blot检测表明目的蛋白具有良好的免疫原性。说明表达系统p EASY-E1/BL21能高效表达金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ蛋白。     

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5).经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.免疫试验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用.用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗2 MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击.由此表明,构建的工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株.     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术，将用PCR扩增来的VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体pBin438中，成功构建了重组表达质粒pTh—VP4-ST和pB—VP4ST。将pTh—VP4-ST进行SDS-PAGE分析，结果表明，表达的目的蛋白以包涵体形式存在，大小约40ku；同时将pB—VP4一ST转化了农杆菌EHA105。     

新城疫病毒SX-1株F基因定点突变及真核表达研究

根据已发表的分离自麻鸡的新城疫病毒SX-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,引物中含有突变位点.应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F基因,使改造后的F基因编码的氨基酸裂解位点为112GlyArg-Gin-Gly-Arg-Leu117.在EeoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点将F基因与转座载体pFastBac Ⅰ连接,获得重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定,核苷酸序列测定正确的pFastBac-F'质粒转化到DH10Bac宿主茵,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F'质粒转染Sf-9昆虫细胞,并进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS-PAGE、Western-blotting检测显示,获得分子量约63 ku的蛋白特异条带,说明F'重组蛋白表达成功.     

猪圆环病毒2型Cap 蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a( )中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

大肠杆菌黏附素蛋白与热稳定肠毒素融合基因植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将编码大肠杆菌黏附素蛋白K88ac与热稳定肠毒素STⅡ的融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pBin48中,成功地构建了植物重组表达质粒pBin48-K88-ST,并将其转化到农杆菌EHA105中,为K88ac-STⅡ基因的进一步研究奠定了基础.     

PRRSV tGP5基因克隆及pcDNA3.1-tGP5真核表达载体的构建

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF5基因的核苷酸序列设计一对特异性引物,用PCR扩增PRRSV GP5蛋白非中和性表位缺失的tGP5基因,将基因定向连接在真核表达载体pcDNA3.1的HindⅢ和EcoRⅠ多克隆位点之间,构建重组质粒pcDNA3.1-tGP5。转化DH5α感受态大肠埃希菌,提取质粒。重组质粒经PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定,成功构建了pcDNA3.1-tGP5基因的重组体。     

牛瑟氏泰勒虫表面蛋白P33基因的克隆与真核表达载体的构建

根据已发表的牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)表面蛋白P33基因的核苷酸序列设计引物,应用PCR技术从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中扩增P33基因片段,克隆到pMD18-T simple载体上,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序分析。进一步将该基因插入到真核表达载体pVAXⅠ,为今后深入研究该基因的表达及其功能奠定了基础。     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ与Ⅲ的反应原性和免疫原性比较

为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明：含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋...     

成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列，设计合成了2对引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM—TA2。用BamHⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ双晦切pGEM-TA1和pGEM—TA2．均得到大小为895bp的ShT-A基因片段，分别与pQE30和pET21a（＋）原核重组表达载体连接．构建pQE30-A2和pET-21A，原核重组表达质粒。工程菌M15／pQE30-A2和BL-21／pET-21A1经lPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E．coli细胞产生毒性作用。DNAsis软件分析ShT-A基因序列，发现在513bp处有HindⅡ位点．以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅡ从pGEM-TA。切出1个513bp的截短片段．重新插入表达载体pQE30．经PCR和双酶切鉴定正确后，得到pQE30-A513重组表达质粒．转化E．coli M15经IPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，在20000处出现1条特异性的表达蛋白带．与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析，试截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37．4％，主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明．表达的重组ShT—A513，蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达及其GM1结合活性分析

为获得表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的乳酸菌表达系统,并分析其免疫反应性和神经节苷脂受体(GM1)结合活性,本研究将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建重组质粒pPG-2-eltb,电转化于干酪乳杆菌393中。筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot和间接ELISA方法鉴定LTB表达情况,并检测其与GM1结合活性。结果显示,目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。GM1-ELISA试验结果证实表达的LTB可与牛GM1特异性结合。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。     

犬新孢子虫SRS9基因真核重组质粒的构建及在Vero细胞中表达

为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。