应用特异PCR方法诊断2例猪弓形虫病

[目的]应用特异PCR方法诊断猪弓形虫病。[方法]分别以弓形虫核糖体DNA第一内部转录间隔区(ITS1)序列和529 bp重复序列为目的片段,扩增2例疑似猪弓形虫病的病料肺门淋巴结DNA,对疑似猪弓形虫病的病料进行PCR诊断。[结果]2对引物均能分别扩增出2例肺门淋巴结中弓形虫DNA的特异条带。[结论]基于2种扩增片段的PCR方法均具有较高的特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法。     

猪弓形虫病的实验室诊断与治疗

[目的]对猪场发生弓形虫的病例进行诊断和治疗,并提出防治措施.[方法]通过猪的临床检查、脏器的剖检变化观察、病料的染色镜检和PCR方法对疑似弓形虫病进行诊断.对病猪采用复方磺胺嘧啶钠治疗,对全群猪口服磺胺脒预防.[结果]通过病猪的临床症状、剖检变化确定为弓形虫病,染色镜检能观察到虫体,通过PCR扩增出病猪脏器中弓形虫的特性条带.[结论]复方磺胺嘧啶钠能控制该猪场弓形虫病的病情.     

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重POR检测方法的建立

[目的]建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法.[方法]以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR 引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx) 的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单-PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法.[结果]此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%, RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%.[结论]应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原.     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

新疆阿拉尔垦区猪嗜血支原体PCR检测方法的建立

[目的]掌握阿拉尔垦区猪嗜血支原体的流行现状。[方法]根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列（U88565）设计1对特异性引物,对采自新疆阿拉尔垦区的样品进行PCR扩增,并将其产物克隆到pBR322载体后测序。[结果]扩增出的片段为0.836 kb。同源性分析结果表明,该序列与猪嗜血支原体参考基因组序列同源性为99.47%,反映出我国分离株与国外株基因同源性较高。[结论]建立了一种猪嗜血支原体PCR检测方法,该方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段,并为相关基因的表达及功能研究奠定了基础。     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18SrDNA和5.8SrDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

猪弓形虫病PCR诊断方法的建立

以具有35个拷贝的重复序列B1基因作为弓形虫种特异的遗传标记,建立诊断弓形虫病特异性的PCR方法.敏感性和特异性试验结果表明:该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子DNA,且与寄生于猪体内的6种常见微生物无交叉反应,说明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性.动物感染试验检测结果表明,在试验动物出现明显临床症状时,对取材的7个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中扩增结果最清晰的的组织为肺和肝组织.     

沙门氏菌invH基因的序列分析与分子检测

根据沙门氏菌的invH基因序列设计1对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株和5种非沙门氏菌株进行PCR扩增,结果3种标准沙门氏菌株均扩增出479 bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增。对3种标准株的扩增片段进行克隆及序列分析,证实沙门氏菌的invH基因序列比较保守;对19种地方分离沙门氏菌进行PCR特异性检测,结果有16株扩出特异性条带,表明本研究建立的沙门氏菌检测方法具有较高的特异性。     

猪弓形虫PCR检测方法研究及初步应用

以微线粒体MIC3基因作为弓形虫特异的遗传标记,建立了猪弓形虫特异PCR检测方法。经过试验摸索出猪弓形虫PCR检测的最佳反应条件,对敏感性和特异性进行研究,该方法能特异性地扩增出弓形虫基因组中相应片段,与微小隐孢子虫,贾第虫、旋毛虫和球虫等相关寄生虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到10个弓形虫速殖子的DNA。该方法的各项指标达到了弓形虫的检测要求。     

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

 【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529 bp重复序列的变异进行研究，从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后，用PCR方法对10个虫株的529 bp重复序列进行扩增；扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆，然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529 bp重复序列都不完全相同，它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529 bp重复序列可作为遗传标记，用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定，但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆及真核表达质粒的构建

根据GenBank数据库中的RH株弓形虫表面抗原1(SAG1)基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株速殖子基因组DNA中扩增编码SAG1的基因片段.PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后测序,并进行序列分析.结果表明:从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1 008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符,与已知的SAG1基因核苷酸序列(GenBank登录号:S76248)的ORF和氨基酸序列的同源性均为99%.     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别.     

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

湖北省高热病猪链球菌的分离鉴定和对小鼠的致病性研究

 【目的】从湖北省不同地区的高热症病例猪的心血、肝、淋巴结、肾和肺等分离出11株链球菌,进行血清型、毒力基因分布和病理学的初步研究。【方法】通过ATB自动生化鉴定系统Rapid ID 32 STREP链球菌鉴定、PCR分型、毒力基因的PCR检测及动物试验对分离菌株进行试验。【结果】11株均为猪链球菌,其中1株为7型,2株为9型,另8株为其它型,没有1型和2型。对11株猪链球菌的mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh6种毒力基因的分布情况进行PCR检测及动物试验表明：致病性和致死性较强的菌株毒力基因表型多为epf+orf2+fpbs+gdh+,显示除mrp、sly外,其它毒力因子也与菌株毒力相关。病理学变化表明急性死亡多表现为急性败血症症状,全身各组织器官广泛出血,以及肺炎、肾炎,脾脏淤血水肿和淋巴结脓肿。【结论】湖北省存在7型和9型的猪链球菌感染,猪链球菌在高热症中具有一定致病作用。     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。