鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

本研究以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5'端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入pMD18-T载体,构建成pMD-A、pMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录,然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代。收获的细胞传代培养物分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果表明蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5’非翻译区中一顺式结构因子对病毒感染必要性的分析

人们广泛认为动脉炎病毒的基因组5’非翻译区(untranslated region,UTR)在病毒基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录和蛋白翻译过程中发挥关键作用,然而其结构与功能仍然在很大程度上不为人知。现基于2型猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆pAPRRS的基础,构建了一系列5’UTR的5’末端缺失突变体,利用RNA和DNA转染,分析了拯救病毒的遗传学与病毒学特征,发现拯救病毒的5’末端突变位点被一些不知来源的AU-rich外源序列所修复。基于T7启动子与CMV启动子转录起始位点的不同,我们人为引入一段GC-rich的序列以研究病毒的自我修复是否为模板依赖性,结果发现病毒的外源序列修复机制是非模板依赖的。通过二级结构预测分析发现,在PRRSV5’UTR中的第一个茎环结构是病毒感染性必不可少的。     

猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

宿主菌株及培养温度对乙型脑炎病毒cDNA克隆稳定性的影响

本研究旨在探讨宿主菌株及培养温度对JEV cDNA克隆在宿主菌中稳定性的影响。选取猪源乙型脑炎病毒基因Ⅰ型HEN0701株和基因Ⅲ型SH0601株为研究对象，分别将两毒株基因组克隆中不稳定的质粒转化不同大肠杆菌菌株，并改变转化菌的培养温度，将不同条件下培养的质粒进行序列分析。试验结果表明，不同宿主菌株对重组质粒不稳定性的影响不显著；低温培养可以克服克隆序列的不稳定。对获得的突变质粒的分析结果显示，基因组5'端的3个起始密码子和E蛋白可能与质粒的不稳定性相关。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

１PPV的基因组结构和复制型DNA的特点PPV为细小病毒科细小病毒属的成员，是一种自主复制性细小病毒（autonom－ouslyreplicatingparvovirus），其基因组为单链线壮DNA分子，大小约５０００个核苷酸（nt），成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组。基因组两端均有发夹结构，３’－端的１０２nt的回文序列中断，折叠形成Y型结构；５’端有一个１２７nt的回文序列，中间被一个２４nt的短回文序列中断，折叠形成U型结构。PPV基因组的这种末端结构对其复制是非常重要的。PPVDNA完全依赖于宿主DNA的复制机制进行自身复制，并且几乎只能在…     

家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

鹅IGF-Ⅰ基因5’调控区序列的克隆与分析

根据鸡、鸭等的IGF-Ⅰ基因5’调控区的保守区序列设计一对兼并引物,从五龙鹅的基因组DNA中扩增了IGF-Ⅰ基因5’调控区序列,将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,结果得到长796 bp的序列。五龙鹅IGF-Ⅰ基因5’调控区序列与鸭、鸡的同源性分别为98.1％、93.0％,充分显示了IGF-Ⅰ基因在进化上的高保守性;与鸭相比有4处碱基缺失和7处碱基插入;与鸡相比有4处碱基缺失和3处碱基插入。对其序列进行酶切图谱分析发现,共有5种常见的限制性内切酶的酶切位点。     

新型鸭肝炎病毒疫苗候选株的筛选

本试验对临床患病鸭分离的一株疑似鸭肝炎病毒进行了血清型鉴定和毒力测定。利用Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒鉴别引物对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;将分离病毒分别与Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验;根据测定的病毒ELD50,进行雏鸭攻毒和鸭胚肝细胞接毒试验。结果表明:RT-PCR扩增出了与新型鸭肝炎病毒预期片段相符的705bp条带;分离病毒不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和,新型鸭肝炎病毒阳性血清对该病毒的中和效价是1:200,说明该分离株属于新型鸭肝炎病毒。该毒株的ELD50为10-5.7/0.2mL,能引起攻毒鸭与临床病例一致的症状和病变以及显著的肝细胞病变,可作为新型鸭肝炎病毒的疫苗候选株开发应用。     

韩国型鸭肝炎病毒福建株的分离与鉴定

从福建省某养鸭场罹患鸭肝炎的病死鸭中分离到1株大小35～45 nm、十二面体对称的无囊膜病毒(暂命名为FJ01株),其鸭胚半数致死量(ELD50)为10~(-2.69)/0.2 mL,该病毒可被特异性韩国型鸭肝炎病毒免疫血清所中和,可被韩国型鸭肝炎病毒特异引物所扩增,而不能被1型鸭肝炎病毒引物所扩增。遗传进化分析表明鸭肝炎病毒FJ01株与韩国型鸭肝炎病毒关系密切,它们在进化树中共处一群。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒VP1基因片段的克隆与表达载体的构建

为研究鸭肝炎病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达情况,根据鸭肝炎病毒核苷酸序列设计1对外引物和1对含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的内引物。以内外引物进行PCR扩增,将所得PCR产物回收,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,并转入宿主菌BL21和Rosseta,经酶切、PCR和测序鉴定,证明VP1基因正确插入了表达载体。用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,VP1基因片段在大肠杆菌Rosseta和BL21中均难以表达。     

新型鸭肝炎病毒分离株JFX08全基因组测定与分析

对我国鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)分离株JFX08的全基因组进行了序列测定与分析。结果表明,JFX08毒株的基因组全长为7793nt,包括652nt的5’UTR,6753nt的ORF,366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08毒株的ORF编码2251个氨基酸,各基因均与韩国新型毒株的氨基酸序列相似性最高,与1型DHV和台湾新型DHV的序列相似性均较低。其中VP1较1型DHV存在2个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～194位和213～219位。JFX08毒株的非编码区核苷酸序列之间存在大量碱基突变和插入/缺失。多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因进化分析结果均表明,JFX08分离株与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

鸭肝炎病毒GD株的分离与RT-PCR鉴定分析

本研究分离了1株鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV),并对其进行了分型研究。取广东某鸭场疑似DHV致死8日龄雏鸭肝脏,肝脏组织处理后经鸭胚接种分离纯化病毒。分离毒株经动物回归试验、ELD₅₀测定、中和试验等确定为血清Ⅰ型DHV,同时通过RT-PCR检测及序列分析,从基因分型角度也验证分离毒株为DHV-Ⅰ,并将该分离毒命名为GD株。     

鸭肝炎病毒GD株的全基因组序列测定与分析

为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5’端和3’端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。     

新城疫病毒LaSotaC5株感染性克隆的构建及病毒拯救

将本实验室保存的一株LaSota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为LaSotaC5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照LaSotaC5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长eDNA的转录载体TVT．LaSotaC5。将TVT-LaSotaC5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI—L共转染BSR—T7／5细胞,成功拯救出了具有感染性的LaSota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。     

光生物素标记的口蹄疫病毒cDNA探针的制备及其对口蹄疫病毒RNA检测的试验研究

本文首次报道了利用pF1034质粒制备FMDV O型特异性探针,并通过PCR反应扩增FMDO_1K株病毒基因组的第2962位与3071位之间共110bp序列,制备了能检测O型、A型和亚洲I型FMDV RNA的群(组)特异性探针。用硝酸纤维素膜斑点杂交试验表明,二者均能检测出10pg水平的O_9K毒株的纯RNA;但前者只与O型FMDV RNA杂交,与A型及亚洲I型FMDV RNA无交叉杂交现象;而后者则能与O型、A型和亚洲I型的FMDV RNA发生杂交反应。对照试验显示:此两种探针与SVDV ssRNA、BTV dsRNA、EHDV dsRNA、DHV ssRNA、PRV DNA、乳鼠组织细胞RNA、BHK_(21)克隆13细胞RNA及DNA等均不出现交叉杂交现象,但与IBR DNA有假阳性杂交反应。     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。