凡纳滨对虾血细胞蛋白制备及其双向电泳体系的建立

为建立凡纳滨对虾血细胞蛋白质的双向电泳体系,实验将凡纳滨对虾血细胞蛋白质提取后,用双向电泳技术(2-DE)分离蛋白质,分别对蛋白质样品的制备方法、不同pH值范围IPG胶条、上样量等关键因素进行了探索和优化。结果显示,采用裂解液裂解-10%TCA/丙酮沉淀法制备蛋白质样品,使用17 cm pH值5~8的IPG胶条进行第一向等电聚焦电泳,第二向SDS-PAGE电泳采用浓度为12.5%的凝胶进行,上样量为每胶条200μg蛋白,第二向电泳后的凝胶采用硝酸银染色,扫描得到的凡纳滨对虾血细胞蛋白质双向电泳图谱蛋白质分离程度好、蛋白点清晰、分辨率高、横纹少等优点。文章建立并优化了凡纳滨对虾血细胞蛋白质组学的双向电泳技术体系,为进一步开展对虾等甲壳动物的蛋白质组学研究奠定了基础。研究表明,该双向电泳体系适用于凡纳滨对虾血细胞蛋白质的分离,可用于后续凡纳滨对虾血细胞蛋白质组学的研究。     

副猪嗜血杆菌菌体蛋白的提取及蛋白质双向电泳方法建立

为了建立副猪嗜血杆菌菌体蛋白的双向电泳方法,获得背景清晰、蛋白分辨率高的双向电泳图,对细菌裂解方法、蛋白上样量、IPG胶条选择等关键步骤进行优化。结果显示,采用超声(9.9 s/停顿9.9 s,200 W)冰浴破碎细菌,5 min后,裂解液溶解沉淀,4℃过夜裂解提取菌体蛋白,以0.6 mg菌体蛋白上在p H值3~10非线性IPG胶条上进行电泳,最后考马斯亮蓝G250染色,获得的蛋白质点清晰,效果最好,随机挑取14个蛋白点进行质谱鉴定,证实均为副猪嗜血杆菌菌体蛋白。     

双向电泳分析鸡羽髓蛋白组学方法的建立

为建立双向电泳方法研究鸡羽髓蛋白组学,以进一步了解病毒与宿主相互作用的新机制,从SPF鸡羽根挤出羽髓,提取其中蛋白进行双向电泳,并对不同裂解液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦条件、二向SDS-PAGE凝胶浓度等影响因素进行优化.结果显示,采用17cm,pH 5～8 1PG胶条,400μg羽髓蛋白进行的双向电泳,图谱用PDQuest8.0.1分析,可分辨的蛋白点约为700左右,不同样本间的匹配率大于80%.可见,本研究建立的双向电泳方法分辨率及重复性均较高.     

雏鸡法氏囊蛋白质组学双向电泳技术的建立及其初步分析

为了建立并优化鸡法氏囊蛋白质组学的双向电泳技术体系,以不同日龄雏鸡的法氏囊组织为研究对象,用固相pH梯度胶条进行等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳,采用不同的样品制备方法,对上样量、水化、等电聚焦、胶条平衡和凝胶染色方法等进行一系列优化,并应用PDQuest8.0.1软件对图谱进行初步分析.结果显示法氏囊组织在pH 5～8范围、17 cm的2-DE胶上可以得到很好的分离,胶体考染后经PDQuest软件分析,在正常法氏囊组织可检测到800个以上蛋白点,不同2-DE图谱间蛋白点平均匹配率为83.5%,不同日龄雏鸡法氏囊存在有明显表达差异的蛋白质点37个,其中表达上调蛋白点17个,表达下调蛋白点11个,新增蛋白点5个,消失蛋白点4个,试验建立的鸡法氏囊组织蛋白质组双向电泳技术为法氏囊发育进化及其免疫功能的研究提供了新技术和方法.     

内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立

试验旨在建立内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳图谱。采用液氮研磨法提取蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行分离,分别对不同的蛋白质沉淀方法、上样量和SDS-PAGE凝胶浓度进行比较。结果显示,使用2-D Clean-up试剂盒处理、上样量为20 μg、采用10%的SDS-PAGE凝胶浓度时可获得重复性好和分辨率高的双向电泳图谱,便于后续的内蒙古绒山羊皮肤差异蛋白质组学分析。     

鹅肝脏蛋白质提取与双向电泳分离技术研究

利用TCA-丙酮沉淀一裂解液溶解法提取朗德鹅肝脏蛋白质,然后采用常规双向电泳技术对提取的蛋白质进行分离,利用PDQuest软件分析电泳图谱,统计蛋白质点及比较凝胶重复性.试验得到(712±15)个蛋白质点,蛋白主要集中在pI 4.0～7.0和43.0～97.4 ku,重复胶的匹配点数为694个,蛋白质点匹配率为96％,蛋白量的相关系数为0.875.本研究建立了朗德鹅肝脏蛋白双向电泳技术,双向电泳图谱中蛋白位点的分辨率和重复性较高,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础.     

非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸道综合征病毒(HP-PRRSV)的方法,本研究根据ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和HP-PRRSV NSP2基因,分别设计了3对特异性引物和Taq Man水解探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明,该方法仅对ASFV、CSFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的DNA以及猪流行腹泻病毒和猪流感病毒的c DNA发生交叉反应;该方法对ASFV、CSFV和HP-PRRSV的最低检出量分别为61拷贝/μL、11拷贝/μL和41拷贝/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2.5%,具有良好的重现性。用该方法对276份临床样品进行ASFV、CSFV和HP-PRRSV的检测,所有样品的ASFV检测结果均为阴性,CSFV检测单阳性样品6份,HP-PRRSV检测单阳性样品22份,CSFV和HP-PRRSV检测双阳性样品4份。本研究建立的方法为临床样品中ASFV、CSFV和HP-PRRSV的同时检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳方法的建立

蛋白质样品的双向电泳分离效果受各种试验条件的影响较大,针对不同来源的蛋白样品进行试验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱。试验拟建立优化的奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质双向电泳分离体系,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对关键因素进行优化,采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化。通过对试验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高分辨率的奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳分离体系。     

支气管败血波氏杆菌外膜蛋白双向电泳图谱的建立

为建立支气管败血波氏杆菌(Bb)外膜蛋白(OMPs)双向电泳(2-DE)图谱,本研究利用碳酸钠法提取OMPs,并分别对裂解液、pH值、上样量、聚焦条件、染色方法等进行优化。2-DE结果表明,用裂解液5 MUrea、2 M Thiourea、2%CHAPS、2%SB3～10溶解蛋白,pH4～7的13 cm线性胶条考染上样量为750μg、银染上样量为75μg,聚焦条件为500 V,2 h,1 000 V,1 h,8 000 V,2∶30 h,8 000 V,4 h时,能获得聚焦良好、分离清晰的Bb OMPs图谱。本研究首次建立了Bb OMPs的2-DE图谱,为其蛋白质组学研究奠定了基础。     

奶牛乳腺蛋白组分析中蛋白质分步提取方法的建立

全息蛋白质样品提取是蛋白组研究的先决条件,采用3种溶解性质不同的裂解液分步提取奶牛乳腺蛋白组,分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,PDQUest 7.4分析凝胶图谱,发现其与常规方法相比,具有蛋白质提取率高、双向电泳(2-DE)分辨率高等优点。     

一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株的基因组特征

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析.结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 320 nt;与高致病性PRRSV毒株间的全基因组核苷酸相似性为98.6％～98.7％;该毒株基因组的Nsp2编码区除存在与高致病性毒株相同的30个氨基酸的不连续缺失外,还存在468位的氨基酸缺失和在585-586位间插入1个氨基酸,同时,该毒株的结构蛋白GP2、GP3、GP4和M编码区分别存在1个氨基酸的突变.演化分析表明,该毒株尽管与高致病性毒株属于同一亚群,但形成一个独立的小分支.由此表明,该毒株为高致病性PRRSV的变异毒株,说明我国的高致病性PRRSV在流行过程中已出现变异.笔者的研究结果为监测和分析我国的高致病性PRRSV的变异与演化提供了有价值的基因组信息数据.     

Isolation and Identification of Highly Pathogenic PRRSV from a Pig Farm

[Objective] To identify suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm. [Method] The suspected cases of highly pathogenic PRRSV were conducted pathologic anatomy, the gene of PRRSV N protein was amplified by RT-PCR and its sequences were determined and analyzed. [Result] The nucleotide sequence of N protein of N7/N8 isolate shared the consistency of 97.0% with highly pathogenic strains(JXA1, Hu N4, SX-1 and TJ), and that of isolate N9 shared the consistency of 97.3% with highly pathogenic strains, indicating the infected virus in the pig farm was highly pathogenic PRRSV. [Conclusion] This research provides a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infec-tion in swine production.     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中已发表的PRRSV的NSP2基因序列,设计一对特异性引物。针对经典型毒株与高致病性毒株,采用RT-PCR方法扩增,可分别扩增出相应的576bp,486bp的目的片段。从而在检测PRRSV的基础上,进一步区分PRRSV的经典型和高致病性毒株。通过对扩增条件的筛选,成功地建立了猪繁殖与呼吸综合征经典型与高致病性毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,且为PRRSV分离株的鉴定分型及NSP2功能研究奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.     

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp2基因并测序。应用DNAStar 7.0、ClustalX 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%。因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。