牛支原体pdhc基因的克隆、表达及其亚细胞定位

试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。     

致犊牛肺炎牛支原体新疆北屯株的分离鉴定及oppF基因序列分析

为确诊新疆北屯市某牛场致犊牛肺炎死亡的病原,试验无菌采集2头病死牛肺脏组织分离培养牛支原体,并进行特异性PCR鉴定及oppF基因的序列比对。结果表明:分离获得2株牛支原体,分别命名为M.bovis BT-1和M.bovis BT-2;2株分离株的菌落形态呈典型的"煎蛋样";PCR扩增出牛支原体oppF基因片段,与预期大小一致;2株分离株的oppF基因与国际牛支原体标准株PG45的同源性分别为97.3%和97.8%;与HB0801、CQ-70W在同一进化分支上,亲缘关系较近。     

牛支原体武威分离株丙酮酸激酶基因的原核表达及其表达产物的功能检测

为研究牛支原体(Mb)威武分离株丙酮酸激酶(PK)的生物学功能,本研究采用PCR扩增Mb武威分离株PK基因(pyk),在测序的基础上利用over-lap PCR将Mb pyk基因中色氨酸密码子(TGA)突变为可在大肠杆菌中表达的同义密码子TGG,进而构建原核表达质粒pET-pyk并转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白His-PK以可溶性形式表达,且其相对分子质量约为57 ku。纯化该重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,采用western blot分析了PK在Mb细胞内的分布,并采用补体依赖的细胞毒试验和粘附及粘附抑制试验分别检测His-PK抗血清介导的补体杀Mb作用及His-PK抗血清对Mb粘附胎牛肺细胞(EBL)的抑制作用,结果表明Mb PK在细胞膜及细胞质中均有分布,且His-PK抗血清具有明显的介导补体杀灭Mb作用和抑制Mb对EBL的粘附作用。本研究为进一步探究Mb的生物学功能奠定了基础。     

牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立

旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测。     

8株牛支原体分离株P81表面膜蛋白基因的克隆与序列分析

本研究对我国采集自8个省份患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原分离鉴定,得到8株牛支原体(M.bovis)分离株。参考GenBank中已发表的M.bovisPG45株的P81基因序列,设计引物扩增P81基因,将其克隆到pMD-18T上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及分析。结果显示,P81基因全长2097bp,含有1个开放性阅读框,编码699个氨基酸。这8株M.bovis分离株的P81同源性为99.4%～99.9%,与PG45株同源性94.6%～94.9%,与无乳支原体(M.agalacia)PG2株同源性仅为73.8%～74%,结果表明,M.bovisP81基因基因高度保守,种间差异较大,具有研究前景。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。     

牛支原体临洮分离株NOX-1的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究

为研究牛支原体(M. bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M. bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基因,在完成测序后构建NOX-1基因原核表达载体pET-NOX-1,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达。表达产物纯化后进行酶活测定并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在M. bovis内的分布进行初步定位。结果显示,M. bovis临洮株NOX-1基因全长1365 bp,重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白His-NOX-1的分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促反应最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L·min);Western blot及间接ELISA结果表明His-NOX-1在M. bovis细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。本研究结果为进一步研究M. bovisNOX-1的生物学功能奠定了一定的基础。     

牛支原体GAPDH定点突变、原核表达及生物学特性初步分析

根据已发表的牛支原体GAPDH基因序列设计引物,从牛支原体湖北分离株扩增出GAPDH基因,亚克隆于载体pET-30a。设计定点突变引物,采用环状PCR法对载体上GAPDH基因进行两轮定点突变,原核表达突变成功的重组质粒,获得重组牛支原体GAPDH蛋白,经Western-blot证实该重组蛋白具有较好的反应原性,为其在牛支原体病防控中的应用奠定了基础。     

猪嗜血支原体OxaA基因的同义定点突变、克隆及在Vero细胞中的表达

为真核表达猪嗜血支原体(Mycoplasma suis)膜蛋白OxaA基因,本实验采用PCR技术扩增包含OxaA基因全长在内的1 561 bp序列,通过引物突变法对OxaA基因内部的两个编码蛋白障碍的碱基进行同义定点突变,应用Overlap PCR技术将3对引物扩增得到的OxaA片段进行拼接,获得能够正确翻译膜蛋白的OxaA基因序列,将鉴定正确的pVAX-OxaA重组质粒转染Vero细胞,应用IFA和western blot方法鉴定OxaA基因在Vero细胞中的表达.结果显示,突变的OxaA基因经Overlap PCR扩增获得长度为747 bp的基因片段,与GenBank中M.suis基因组的核苷酸序列同源性为98％,IFA检测OxaA基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为29 ku,具有较好的反应原性.本实验首次在真核细胞中表达了M.suis的QxaA基因,为M.suis基因疫苗的研究奠定了基础.     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析

本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因,并确定病原体.无菌采集3份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品.采用牛支原体专用液体培养基和1.0%牛支原体琼脂固体筛选培养基从3份病死犊牛肺脏病料中分离得到2株牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis),分别命名为M.bovis-NJ-1和M.bovis-NJ-2.通过菌落形态学观察、特异性PCR和oppF测序比对对分离株进行鉴定.结果显示,2个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的"煎蛋状",且Dienes染色特点符合牛支原体菌落着色特征,中心呈深蓝色;PCR能扩增出牛支原体特异的448 bp目的片段;2个分离株的oppF基因序列与牛支原体国际标准株PG45的同源性分别为96.7%和95.3%.结果表明,引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体,本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据.     

牛支原体贵州株TU基因的克隆及序列分析

为了解牛支原体(M.bovis)贵州株GZ1、GZ2 TU基因的生物信息学特征,试验对牛支原体贵州株TU基因进行克隆测序和序列分析,应用DNAStar软件对TU基因推导氨基酸序列蛋白亲水性、表面可及性、骨架柔韧性及抗原指数进行预测和分析。结果表明:TU基因克隆测序基因片段长度为1 009 bp,与预期相符。TU基因序列分析显示,牛支原体GZ1株与PG45标准株同源性为99.1%,与GZ2株同源性为99.0%。基因变异性显示,参考牛支原体标准株PG45,GZ1株在第55,134,191,257,389,512,674位发生了突变,在第178,951,962位发生了缺失,GZ2株仅在273位发生了突变。进化树分析显示,GZ1株与国内分离株属同一分支,进化关系近。GZ1株与GZ2、PG45株属不同分支,并且与国外的分离株进化关系较远。TU基因B细胞抗原表位预测结果显示,该蛋白亲水性、表面可及性、骨架区柔韧性都较好,抗原指数高,且分布相对均匀。该蛋白整体区域抗原优势明显,具有良好的抗原性。说明牛支原体TU基因相对保守,各地区分离株存在一定的进化关系。     

牛支原体湖北株的分离鉴定及其oppF基因的进化分析

牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一。从湖北恩施暴发牛支原体的肉牛场(70头引种肉牛出现20%的死亡)分离得到一株牛支原体,命名为HB2015,并对其进行了保藏(保藏号:CCTCC M 2016559),进化分析结果显示该菌株与M.bovis NM2012内蒙株亲缘关系较近,为牛支原体的防控提供了理论依据。     

牛分枝杆菌与鸟型分枝杆菌2型重组蛋白Ag85b的血清学交叉反应研究

牛分枝杆菌(M.bovis)是引起牛结核病的常见病原,而鸟分枝杆菌(M.avium)2型则通常交叉感染牛,但不会导致严重的病变.为鉴定M.bovis和M.avium的免疫交叉反应情况,本研究分别以M.bovis和M.avium 2型的基因组为模板,扩增ag85b基因,分别构建了M.bovis和M.avium的原核和真核表达重组质粒进行表达.以原核表达纯化的两种重组蛋白Ag85b (rAg85b)分别作为包被抗原,交叉检测两种真核重组质粒免疫豚鼠制备的抗血清.结果表明,原核表达的M.bovis和M.avium rAg85b与真核重组质粒免疫豚鼠制备的两种抗血清之间存在较强的免疫交叉反应.研究结果揭示M.bovis和M.avium的Ag85b蛋白存在很强的血清学交叉反应,这将严重干扰M.bovis Ag85b作为候选疫苗的免疫监测.     

牛支原体PepO原核表达及功能验证

牛支原体是严重危害养牛业的重要病原体,阐明其毒力因子和致病机制有助于防控技术的研发。内肽酶O(PepO)参与肺炎链球菌在猪体的致病过程,本研究旨在探讨PepO在牛支原体中是否具有毒力相关功能。利用巢式PCR将牛支原体PepO中的色氨酸密码子TGA突变为大肠杆菌的色氨酸密码子TGG,进一步克隆至大肠杆菌原核表达载体,成功表达重组蛋白PepO。利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备针对PepO的高免血清,经Western-blot分析显示出多抗血清结合,可激活PLG的结构域,从而发挥降解特异性底物S-2251的纤溶酶功能。比较分析牛支原体PepO突变菌株T5.37与野毒株HB0801的生长及对牛肺上皮细胞EBL的黏附特性,其结果显示PepO缺失显著降低牛支原体对EBL的黏附。本研究证实了牛支原体PepO具有活性,参与宿主细胞黏附过程,是一个潜在的毒力相关因子,为进一步研究阐明牛支原体致病机制奠定了基础。     

牛支原体免疫相关性蛋白硫锌酰胺脱氢酶的筛选与鉴定

为鉴定牛支原体(M.bovis)菌体免疫相关蛋白及其免疫原性,本实验以M.bovis湖北株为样品,通过建立M.bovis全菌蛋白的双向电泳体系,获得了分辨率及重复性良好的双向电泳(2-DE)图谱。利用western blot技术进行筛选,鉴定得到多个M.bovis蛋白,其中一个分子量为68 ku,经过质谱分析和氨基酸一级结构比对确定该蛋白为硫锌酰胺脱氢酶(LipDH)。经原核重组表达,LipDH重组蛋白与M.bovis阳性血清的western blot反应为阴性,而Dot blot及以重组表达蛋白作为包被抗原的ELISA鉴定结果均为阳性。本研究为进一步研究LipDH的功能以及采用其重组蛋白用于该蛋白缺失的M.bovis疫苗株的鉴别检测方法的建立奠定了基础。     

牛支原体新基因(P18)的克隆表达及活性鉴定

牛支原体(M.bovis)可以引起犊牛肺炎、关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎等疾病,是一种牛的重要呼吸道病原体,目前M.bovis粘附宿主细胞的机制还不明确。研究表明,M.bovis表面存在的多种蛋白与致病菌在宿主体内的侵袭力与传播能力有关。我们通过分离表达多个M.bovis基因,最终获得了一个表达纤溶酶原结合蛋白的新基因,并命名为P18。该基因表达大小约为67ku的重组蛋白。通过western blot鉴定,重组表达的P18蛋白可以被M.bovis抗体识别。进一步的试验表明,P18蛋白还具有纤溶酶原结合活性,从而推测该基因表达的蛋白可能是M.bovis的一个粘附相关因子。     

基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及应用

为快速检测牛支原体(M.bovis),根据GenBank中登录的M.bovis P81基因序列设计特异性引物,通过条件优化,建立了M.bovis环介导等温扩增(LAMP)检测方法。将该方法的灵敏度与巢式PCR进行对比,并用其检测牛支原体外的其他几种病原菌,同时对疑似感染M.bovis的临床病料进行检测。该方法的灵敏度比巢式PCR高103倍,最低检出限为1.1ng/L,对其他几种病原菌的检测结果均为阴性,临床病料检测结果与分离培养符合率为100%。建立的M.bovis LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速准确,且不需要专门的仪器设备,可用于牛支原体病的临床检测。