牛传染性鼻气管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立1种特异、灵敏、高效的检测IBRV gE基因的荧光定量PCR方法,并为鉴别IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技术手段.方法 根据IBRV gE基因保守序列,设计一对引物,建立荧光定量PCR反应体系和反应条件,利用10倍梯度稀释病毒DNA进行荧光定量PCR扩增,以检测本试验建立的荧光定量PCR的灵敏度.用IBRV、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞、牛血清等进行特异性检测.用模拟样品进行临床应用试验.结果 本试验建立的荧光定量PCR方法,其灵敏度约为70 DNA拷贝/μL,除了IBRV从其他病毒和样品未扩增出曲线,临床模拟样品检测结果为0.03TCID50.结论 本试验建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏性高、快速,低污染等优点,因此临床上可以用于IBRV的检测和病原学调查.     

牛轮状病毒二温式PCR检测方法的建立

根据牛轮状病毒（Bovine rotavrius,BRV）的群特异性基因VP6设计了1对特异引物,建立并优化了能够快速检测BRV的二温式PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,该二温式PCR只对BRV敏感,可扩增获得大小为385 bp的特异性条带,其敏感性为最低能检测到1 pg的BRV RNA;而对其他病毒不敏感。说明所建立的BRV二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温武多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp.特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA.建立的BVDV和BRV二温武多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法.     

牛传染性鼻气管炎病毒XA株的分离与鉴定

【目的】利用MDBK细胞进行牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)XA株的分离与鉴定。【方法】用MD-BK细胞从陕西发病奶牛鼻拭子中分离IBRV;使用IBR标准阳性血清对该病毒分离物进行中和试验;根据GenBank公布的IBRV基因组序列,利用gB保守序列设计1对引物,对分离病毒进行PCR扩增并测序。【结果】分离病毒在MDBK细胞上产生了明显的特征性细胞病变(CPE):细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,偶见含有几个细胞核的巨大细胞;用标准抗IBRV特异性抗血清能完全中和分离株;用IBRV gB特异性引物进行PCR,可扩增出1 182 bp的特异性条带,目的序列与已发表的IBRV基因组序列一致。【结论】该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒,将其命名为IBRV XA株。     

奶牛卵巢中一株IBRV的分离鉴定

利用MDBK细胞从奶牛卵巢中分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)毒株。设计扩增IBRV的通用引物,对卵巢组织中的病毒进行PCR扩增及测序;对卵巢组织感染MDBK细胞,进行IBRV的分离培养;测定IBRV的TCID_(50),同时利用IBRV FA进行鉴定。结果表明,分离到的病毒在MDBK细胞上产生了明显的病变;用特异性引物可扩增出特异性目的条带,目的序列与IBRV基因序列一致;该毒株的病毒滴度为10~(6.75) TCID_(50)/mL。     

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。     

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40~400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。     

PCR检测兔支气管败血波氏杆菌方法的建立及应用

为建立准确、快速检测兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)的PCR方法,根据Gen Bank中波氏杆菌ptxA基因设计1对特异性引物,用建立的PCR方法扩增兔波氏杆菌,可扩增出870 bp的目的片段。该方法特异性好,仅对波氏杆菌有特异性的扩增,而对大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌等病原菌的扩增结果呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.8×10~(-7)μg/m L;用建立的PCR方法检测临床疑似感染支气管败血波氏杆菌病兔的脏器及鼻拭子样品,可扩增出目的条带,且与细菌分离的结果一致。可见,建立的检测方法敏感、特异,可用于临床上兔波氏杆菌病的快速诊断及鉴定。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立

根据Genbank发表的牛呼吸道综合征相关病毒中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)N基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR和牛副流感3型病毒(BPIV3)N基因设计特异性引物,建立了在同一体系内同时对4种病毒进行检测的多重PCR方法。该方法可以同时检测出DNA病毒IBRV的长306bp和反转录病毒BPIV3长422bp、BRSV长600bp及BVDV长130bp的特异性片段。本项研究中以已知IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV作为参考毒株,对来自内蒙古、辽宁、安徽和吉林4个省、自治区的33例临床样品进行检测。结果表明,合并感染2种病毒较为多见,分别为BVDV和BRSV共感染,BPIV3和BRSV共感染,BPIV3和IBRV共感染,未检测到4种病毒同时感染临床样品。     

牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用

本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立一种犬瘟热病毒(CDV) RT-nested PCR检测方法.[方法]根据CDV弱毒株Onderstepoort 的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验.[结果]特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带.敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者.重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同.用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT- nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品.[结论]建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。     

犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

为快速、准确检测犬巴贝西虫病,根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列,设计合成1对特异性诊断引物,建立了PCR诊断方法。结果扩增出了犬巴贝西虫18sRNA基因的一段大小为319bp片段,经测序,所扩增序列与报道的序列完全匹配。同时对附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品进行扩增没有出现扩增条带。阳性犬全血DNA稀释1 000倍后,依然可以有效地检测出虫体DNA。结果表明,所建立的PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性,可以运用于临床检测巴贝西虫病。