抗氨苄青霉素单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青 霉素(Ampicillin,AMP)与匙孔嘁血蓝蛋白 (mcKLH)偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠, 应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓 瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单 克隆抗体的杂交瘤细胞株。同上方法将氨苄 青霉素连接到阳离子化的牛血清白蛋白(cB SA)上制备检测抗原,对AMP KLH偶联物 免疫小鼠产生的抗体进行检测。通过对杂交 瘤细胞培养上清的检测、鉴定,筛选出8株高 亲和力的杂交瘤细胞株,用其制备的腹水 ELISA效价达到2×106,纯化后的单克隆抗 体(McAb)可以应用于氨苄青霉素残留的快 速检测。     

人参皂苷Re多克隆抗体的制备

为了制备半抗原人参皂苷Re的特异性多克隆抗体,用过碘酸钠法构建了Re和牛血清白蛋白（BSA）的偶联物作为抗原,分5次免疫新西兰大白兔、取免疫前的新西兰大白兔血清作为空白对照,第5次免疫后采取血清,通过酶联免疫法（ELISA）鉴定血清中Re多克隆抗体的效价,再用竞争性抑制法检测抗体的灵敏性和特异性。,结果表明,抗原Re—BSA偶联物制备成功,第5次免疫后,抗体的效价达到1：40960,与其他人参皂苷交叉反应率低于2％,特异性强,可用于人参皂苷Re的检测。     

四环素多克隆抗体的制备及鉴定

为了研究四环素(TC)多克隆抗体的制备方法,试验采用碳二亚胺法制备TC完全抗原,将制备好的免疫抗原对昆明鼠进行免疫,免疫结束后对小鼠进行眼眶取血,获得TC多克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价,通过间接竞争ELISA法测定多克隆抗体特异性。结果表明:该多克隆抗体效价达到1∶32 000以上,抗体浓度为4.36 mg/mL;与氯霉素、特布他林、沙拉沙星等常用兽药无交叉反应。说明制备的TC多克隆抗体特异性强。     

磺胺甲噁唑抗原合成及其抗体的制备

采用重氮化法将磺胺甲噁唑(SMZ)与人血清白蛋白偶联形成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描和高效液相色谱分析偶联物,免疫抗原的偶联率为19∶1,改良辛酸-饱和硫酸铵纯化抗体,多克隆抗体效价达1∶105,间接酶联免疫吸附试验建立的SMZ检测的线性范围在0.1ng/mL~10μg/mL之间,50%抑制率检测限为22.53ng/mL,抗体与磺胺甲噁唑交叉反应率为100%,与其他7种磺胺药交叉反应率很低。表明制备的磺胺甲噁唑多克隆抗体具有很高的特异性,可用于SMZ在动物性产品中残留的检测。     

山羊IFN-γ免疫血清制备及抗体ELISA检测方法的建立

为制备山羊干扰素-γ(IFN-γ)免疫血清并建立山羊IFN-γ抗体ELISA检测方法 ,以原核表达的山羊γIFN重组蛋白(rIFN-γ)为材料,免疫小鼠制备免疫血清;通过对测定不同的抗原包被浓度及包被时间,酶标抗体稀释度,免疫血清的孵育时间等条件的优化建立检测抗体效价的ELISA检测方法,并采用建立的方法测定免疫血清的抗体效价。结果显示,rIFN-γ抗原包被浓度为10μg/mL,4℃包被12h;酶标抗体稀释度为1∶5 000;免疫血清孵育时间为60min,可以得到最佳ELISA的检测结果。重复试验显示该方法变异系数(CV)在1.5%~5%之间。采用建立的方法测得免疫小鼠免疫血清效价为107。该ELISA检测方法灵敏高,稳定性好,为山羊IFN-γ抗体检测提供了技术支持。     

呕吐毒素单克隆抗体制备及鉴定

为制备一种呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)单克隆抗体(McAb),对DON进行改造,合成了半抗原,然后与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成偶联抗原DON-BSA、DON-OVA,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的偶联抗原进行鉴定。然后用DON-BSA作为免疫抗原,DON-OVA作为检测抗原免疫小鼠制备抗DON的单克隆抗体。结果所得单克隆抗体为IgG1亚型,分子质量为158ku,抗体标准曲线IC50值为1.7μg/L,与T2毒素、黄曲霉毒素B1几乎没有交叉反应,筛选到的单克隆抗体可用于研制DON酶联免疫检测产品。     

四环素多克隆抗体的制备、鉴定及ELISA检测

采用戊二醛交联法和混合酸酐法制备了四环素-BSA完全抗原,分别将两种不同偶联法制备的四环素-BSA完全抗原按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,酶联免疫吸附法鉴定出多抗中含有四环素的特异性抗体,特异性抗体效价最高达1:320000,抑制率为50%(IC50)时的四环素浓度为92.6μg/mL,四环素的最低检测限为6.25μg/mL,四环素和金霉素的交叉反应率达到78%,该方法灵敏度高,为试纸条法快速检测四环素类的残留奠定了基础。     

山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒ORF122蛋白为免疫抗原,构建杂交瘤细胞株,制备ORF122蛋白单克隆抗体。用纯化的ORF122蛋白免疫BALB/c小鼠后,按通用的方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒ORF122蛋白的杂交瘤细胞,制备ORF122蛋白单克隆抗体,获得6株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在104以上。山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备,为山羊痘病毒的进一步研究提供了生物材料。     

抗双氯青霉素单克隆抗体的制备与初步鉴定

采用碳化二亚胺法,将双氯青霉素(dicloxacillin)与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,获得1株可稳定分泌McAb的杂交瘤细胞5D4-C9-C8;间接ELISA方法测定,其细胞上清抗体效价为1∶300,腹水效价为1∶3.5×105,为IgG1,与其结构类似物邻氯青霉素、苯唑青霉素的交叉反应率分别为17.6%和26.1%,与苄青霉素、羟氨苄青霉素和氨苄青霉素均无交叉反应性。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测双氯青霉素的ELISA试剂盒奠定了基础。     

氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。     

单抗阻断ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗体的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌Ａ、Ｃ型特异性单克隆抗体的基础上成功地建立了能区分Ａ、Ｃ血清型抗体的阻断ＥＬＩＳ诊断方法,并应用此法对９种常见病原体阳性血清及多份免疫鸡。     

单克隆抗体在水产养殖中的应用

单克隆抗体具有高度特异性、均质性及来源稳定并可大量生产的优点,成为感染性疾病研究、诊断和治疗的一个有力手段.随着单克隆抗体技术应用的深入,其在水产养殖中也发挥了很大的作用.论文简要介绍了单克隆抗体的技术原理,对单克隆抗体在水产病原细菌性疾病、病毒性疾病的诊断以及水产激素、水产药物残留检测方面的研究及应用进行了概述,对单抗在水产方面的基础性研究工作进行了总结,并对存在问题和发展前景进行了讨论和展望.     

Antibodies as effectors

Antibodies are critical in protection against extracellular microbial pathogens. Although antibodies also play a role in transplant/tumor rejection and in autoimmune disease, this paper focuses on defense against bovine infections. Effector mechanisms of different bovine isotypes, subisotypes and allotypes are discussed. The importance of antigen specificity is also stressed.     

应用单克隆抗体ELISA阻断试验快速检测兔出血症病毒抗体的研究

利用抗兔出血症病毒(RHDV)的特异性单克隆抗体(McAb)建立了ELISA阻断试验用以检测血清抗体,并与血凝抑制(HI)和琼脂扩散试验(ID)进行了比较。结果ELISA阻断试验敏感性超过HI,更远胜于ID,具有灵敏、特异、准确等优点,适于大批血清样品的快速检测。     

禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体，本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT，经IPTG诱导表达后，获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT，利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT，并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法，最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL^-1，最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合，采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体，分别命名为1G8、2C3和2G3，均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示，3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应，而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达，对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定，结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是⁸³DQDWMDS⁸⁹、⁹⁰SNPGTW⁹⁵和¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。     

抗鸡IgG单克隆抗体的研究

利用小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞系与纯化鸡IgG免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,成功地建立了5株能持续分泌抗鸡IgG单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株。选择产生抗体效价高、生长快的C_(44)株,扩大培养后注射于小鼠制备腹水,经硫酸铵盐析粗提后,用HRP标记,制备出McAbs酶结合物。将制备的McAbs酶结合物和多克隆抗体(PcAbs)酶结合物,采用间接ELISA,对35份鸡血清中鸡新城疫病毒(NDV)抗体以及19份鸡血清中鸡嗜血杆菌(HG)抗体进行检测,McAbs和PcAbs两者的相关系数分别为0.928和0.921,证明制备的抗鸡IgG McAbs具有特异性强、效价高的特点.     

Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies

To development monoclonal antibodies against cOmpT of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), the recombinant cOmpT of APEC origin expression plasmid pET-28a-compT was employed, and cOmpT protein with a molecular weight about 36 kD in the form of inclusion bodies was obtained after induction with IPTG, and then renatured by urea gradient dialysis. BALB/c mice were immunized with the purified cOmpT. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) was developed, the optimal coating concentration of the antigen was 0.625 μg·mL^-1 and the optimal serum dilution was 1:6 400. After the fourth immunization, the spleen of immunized mice was collected for cell fusion, three monoclonal hybridomas that can secrete antibody specific to cOmpT were obtained after multiple screenings, named 1G8, 2C3 and 2G3 respectively. And all of their immunoglobulin subclasses were IgG2b. The titers of monoclonal antibodies in the cell culture supernatant were 1:200, 1:3 200 and 1:3 200 determined by iELISA, respectively. All three monoclonal antibodies were confirmed to react with cOmpT in Western blot, without cross reaction with other tested bacteria. The antigenic epitopes recognized by the three monoclonal antibodies were identified by using a series of E. coli strains harboring expression plasmids recombined with truncated fragments from compT gene. The results revealed that the antigenic epitope required for reactivity with the 1G8 was ⁸³DQDWMDS⁸⁹, and ⁹⁰SNPGTW⁹⁵, ¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³were recognized by 2C3 and 2G3, respectively. In this study, three monoclonal antibodies against cOmpT were successfully developed and the antigenic epitopes recognized by the antibodies were identified. The cOmpT specific monoclonal antibodies obtained in this study are potentially useful tools for both the functional study of cOmpT and the development of APEC epitope vaccines.     

用抗原免疫构建分泌兔出血症病毒抗独特型抗体的杂交瘤细胞

用纯化的兔出血症病毒（ｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ,简称,ＲＨＤＶ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。正如网络学说所指出的,从免疫鼠的杂交瘤细胞克隆中,不仅筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ抗体（Ａｂ１）的细胞克隆,同时也筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ独特型抗体（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,Ａｂ２）的杂交瘤细胞,用抗原而不用单克隆抗体（Ａｂ１）免疫,诱导产生抗独特型抗体（Ａｂ２）是一种具有广阔的应用前景的新技术     

鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的研究

用纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＣＡ毒株和Ｂ８７株混合抗原脾内免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，采用间接ＥＬＩＳＡ方法进行筛选，共检出３１个原始阳性孔，阳性率为１５．４％，选择其中３个孔，分别进行３次克隆，最后获得３株杂交瘤细胞，命名为Ｂ２８、Ｂ３４、Ｃ２８。通过与其它禽源病毒的交叉试验证明，分泌的抗体均具有高度特异性。３株细胞的平均染色体数分别为９４、８７、８９