盐酸克伦特罗人工抗原及抗体的制备

为了制备盐酸克伦特罗(CL)人工抗原及抗体,试验采用重氮化法将盐酸克伦特罗与经过活化的牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫抗原(CL-BSA)和检测抗原(CLOVA),经紫外光谱扫描对偶联物进行鉴定;用免疫抗原免疫BALB/c小鼠制备盐酸克伦特罗多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价。结果表明:盐酸克伦特罗人工抗原合成成功,制备的鼠源多克隆抗体效价达1∶64 000,该抗体可用于下一步试验。     

氯霉素人工抗原的合成及其抗体的制备

为了合成氯霉素(CAP)人工抗原并制备抗体,试验建立CAP残留的酶联免疫吸附试验(ELISA)法,采用重氮化法将半抗原CAP与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制得免疫抗原,然后与卵清白蛋白(OVA)进行偶联,制得包被抗原,通过紫外光谱扫描鉴定是否偶联成功;用免疫抗原免疫KM小鼠,制备CAP多克隆抗体,并通过间接ELISA法测定抗体效价。结果表明:通过紫外光谱扫描,CAP-BSA在275 nm处为最大吸收峰,CAP-OVA在276 nm处为最大吸收峰;并且免疫KM小鼠得到的抗体效价高达1∶128 000。说明试验成功制备了CAP人工抗原,并且获得了高效价的多克隆抗体,也进一步证明了药物偶联成功。     

氨苄西林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗体的制备

为了建立氨苄西林(AMP)残留检测的免疫分析方法,试验采用碳二亚胺(EDC)法将AMP与经活化的牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别进行偶联,合成人工抗原AMP-BSA和AMPOVA,通过紫外光谱扫描对人工抗原进行鉴定,将AMP-BSA免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价。结果表明:AMP与载体蛋白BSA和OVA偶联成功,并成功制备了鼠源AMP多克隆抗体,效价高达1∶64 000。     

大片形吸虫CatL1蛋白的原核表达及其特异性多克隆抗体的制备

为了制备大片形吸虫诊断抗体,试验采用原核表达制备大片形吸虫组织蛋白酶L1重组蛋白(rFgCatL1),用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体效价,Western-blot法检测多克隆抗体的特异性。结果表明:CatL1基因大小为981 bp,蛋白质分子质量为39.0 ku左右,与预期分子质量大小一致。制备的小鼠多克隆抗体血清效价达1∶128 000,能特异性识别大片形吸虫排泄-分泌物(ESP)抗原。说明制备的rFgCatL1多克隆抗体可作为良好的诊断抗体用于研制快速诊断试剂盒。     

特布他林人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

为了建立特布他林(TBL)残留酶联免疫检测方法,试验采用碳二亚胺法将TBL与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别耦联,制备TBL人工抗原,经紫外光谱扫描对耦联物进行鉴定;用免疫抗原免疫小鼠制备TBL多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附试验测定抗体效价。结果表明:通过紫外光谱扫描鉴定,TBL-BSA和TBL-OVA存在最大吸收峰值,分别在277 nm和278 nm处;用TBL-BSA免疫Balb/c小鼠,获得的TBL多克隆抗体效价达到1∶32 000以上。说明成功制备出TBL人工抗原,并获得高灵敏度和特异性的TBL多克隆抗体,证明药物耦联成功。     

雌二醇多克隆抗体的制备与鉴定

制备雌二醇完全抗原,并通过免疫家兔得到多克隆抗体,为下一步制备雌二醇单克隆抗体和雌二醇检测ELISA试剂盒奠定基础。试验以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用碳化二亚胺法,合成了雌二醇(E2)的2种免疫偶合物:免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联成功与否,并对偶合物的蛋白含量、结合比进行测定并以免疫原E2-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,用包被原E2-OVA进行ELISA,对多克隆抗体特异性及效价进行检测。结果表明成功合成了雌二醇人工抗原即免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA,二者的蛋白浓度分别为5.455和7.533mg/mL,结合比分别为7:1和8:1;制备的多克隆抗体特异性好,血清效价为1:106。     

ALV-A p27基因的原核表达及其鼠源多克隆抗体的制备

试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

抗腹泻性贝毒软海绵酸多克隆抗体的制备与检测

制备了腹泻性贝毒软海绵酸(okadaic acid,0A)的多克隆抗体,鉴定了抗体特性.利用半抗原BSA偶联小分子毒素OA,制备完全抗原OA-BSA,免疫两只新西兰白兔,分离、纯化抗血清.用间接ELISA方法测定抗体效价,两个兔抗血清效价均达到128,000以上.IC50为2.852 ng/mL.DOT BLOT测定抗体特异性,结果表明,抗体与抗原有特异性反应.试验表明,抗OA多克隆抗体制备成功,其质量较好,可用于将来的免疫检测研究.     

虎源猫瘟热病毒多克隆抗体的制备

为了给猫瘟热的诊断、血清学调查、试剂盒的研制与开发奠定基础,试验以F81传代细胞大量增殖的猫细小病毒-HLJ株毒液为免疫抗原,采用腹腔注射法免疫小鼠制备虎源猫细小病毒多克隆抗体,采用HI和ELISA方法检测多克隆抗体效价,用Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明:免疫获得的多克隆抗体HI效价为27,ELISA效价为1:51200,能够识别虎源猫细小病毒VP2抗原表位基因编码蛋白,具有很高的特异性。     

流行性乙型脑炎多克隆抗体的制备及其囊膜E蛋白ELISA方法的建立

为了建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,试验用纯化的乙型脑炎病毒免疫健康新西兰白兔制备多克隆抗体,并对多克隆抗体进行纯化和效价测定;以纯化原核表达的乙型脑炎重组结构蛋白(E蛋白)为包被抗原,通过对检测方法相关条件的优化,建立了检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;在批内重复试验中,变异系数小于10%。     

氨基脲人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

目的合成氨基脲人工抗原并制备其多克隆抗体。方法以氨基脲(SEM)和对醛基苯甲酸(CP)为原料合成半抗原(CP-SEM),并采用碳化二亚胺法和混合酸酐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成氨基脲人工抗原。以氨基脲人工抗原(CPSEM-BSA)为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA法测定其抗体效价。结果经薄层层析、红外光谱和元素分析等方法鉴定合成半抗原即为CP-SEM。紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明人工抗原合成成功。免疫获得抗氨基脲的多克隆抗体,其抗体效价为1:64000。结论氨基脲人工抗原合成成功,并获得抗氨基脲的多克隆抗体。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

奶牛S100A12蛋白多克隆抗血清的制备

为研究奶牛S100A12蛋白功能提供一种灵敏、高效的免疫学检测试剂,将纯化好的S100A12蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制备成抗原,免疫新西兰大白兔制备S100A12多克隆抗血清,应用琼脂双扩散法、间接ELISA法和Western blot方法检测该抗体的效价及其特异性。结果表明,所制备的S100A12抗血清经琼扩法和间接ELISA法检测效价分别达到1∶8和1∶409 600,同时免疫印迹法证实该抗体能与S100A12蛋白特异性结合。本试验成功获得了特异性强、效价高的S100A12多克隆抗体,为进一步深入研究S100A12基因功能提供了有力工具。     

副溶血弧菌T3SS1 VscF蛋白多肽抗体的制备与应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种世界范围内广泛存在的革兰氏阴性食源性致病菌,其vscF基因编码的T3SS1针状蛋白VscF,在侵袭宿主细胞过程中扮演重要角色。为深入研究VscF蛋白在T3SS1针状结构组装过程中的功能,并制备VscF特异性多肽抗体,利用OptimumAntigenTM抗原多肽设计软件,筛选最佳抗原目标肽段,然后将肽段与KLH载体蛋白偶联后免疫新西兰大白兔,收集兔血清制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western Blot、间接免疫荧光检测方法,鉴定多抗效价和特异性。间接ELISA检测结果显示,该多肽抗体效价达1:512 000,显示出该多肽抗体的高敏感度;Western Blot与间接免疫荧光检测结果显示,该多抗能与原核表达的VscF蛋白发生特异性反应。结果表明,筛选的VscF短肽制备的多克隆抗体敏感度高,可作为VscF验证试验中具有特异性结合作用的抗体,能够为后续生物试剂机理研究奠定基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。     

牛抵抗素多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组牛抵抗素蛋白免疫健康家兔,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化、效价测定、特异性检测,初步建立了检测牛抵抗素的间接ELISA方法。     

抗鸡传染性支气管炎病毒多克隆抗体的制备及其生物活性的鉴定

本试验将商品化疫苗株H120鸡传染性支气管炎病毒(IBV)直接免疫大白兔进行抗IBV全病毒粒子多克隆抗体的制备,通过琼扩试验及酶联免疫吸附试验检测其抗体效价,同时利用免疫组织化学、免疫荧光及Western blotting技术检测了所制备多抗血清的生物活性。试验结果表明,制备得到的多抗血清具有很高的抗体效价,同时能够与不同形式的IBV相关抗原发生特异性结合。     

牛病毒性腹泻病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在通过原核表达获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)衣壳蛋白(C),以制备抗C蛋白多克隆抗体。根据BVDV C蛋白的编码序列设计一对特异性引物,利用PCR扩增编码BVDV C蛋白片段,定向插pPET-42a载体中,转化大肠杆菌BL21 Rosetta (DE3) pLysS感受态细胞,筛选重组阳性菌株,IPTG诱导表达,金属离子层析法纯化得到分子质量为45 kDa的重组C蛋白。利用纯化的重组C蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多克隆抗体效价达到1∶25 600。经间接免疫荧光证实制备的多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的反应性。本研究成功制备了BVDV重组C蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。