基于MALDI-TOF/TOF技术的单增李斯特菌四种血清型的快速鉴别

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。     

银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究

[目的]了解银川市市售食品中单增李斯特菌的污染状况及其血清型和耐药性特点。[方法]以宁夏银川市售各类生鲜食品为原料,菌株的分离鉴定按照GB4789．30—2010《单核细胞增生李斯特氏菌检验》和国家食源性疾病监测网监测方案进行;血清型检验按照血清凝集试验进行;药物敏感性试验按照K—B纸片扩散法进行。[结果]720份食品中检出单增李斯特菌45株,总检出率为6．25％,分属5个血清型,主要为1／2a型。污染率最高的是生鸡肉（8．33％）。耐药性研究表明单增李斯特菌对多粘菌素的耐受最严重,耐药率为77．78％,此外还耐受头孢噻肟、四环素、呋喃妥因、青霉素、红霉素和头孢噻吩,且出现多重耐药。[结论]银川市食品中存在不同程度的单增李斯特菌污染,生肉中单增李斯特菌检出率较高,应加强监测工作。同时存在致病性较强的血清型,呈多重耐药性趋势。     

单核增生李斯特氏菌的分布研究

对采自人和动物粪便、冷链食品、猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鱼肉等640份样品进行李斯氏菌的分离与鉴定,研究了李斯特氏菌的分布状况,检出单核增生李斯特氏菌1株,英诺克李斯特氏菌7株,威尔斯李斯特氏菌1株,格氏李斯特氏菌34株,默氏李斯特氏菌6株;单核增生李斯特氏菌的检出率为0.16%,李斯特氏菌的总检出率为7.66%。     

洛阳地区鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布研究

为分析鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布特征,从洛阳地区市售鸡肉中分离18株单增李斯特菌,血清凝集试验确定其血清型,然后采用PCR方法对inl A、inl B、virR、dlt A、dlt B、dlt C、dlt D及mpr F等8个毒力基因进行检测。结果显示,18株分离株血清型均为1/2型,且有9株具有全部毒力基因,其中inl B、dlt A、dlt B基因全部呈阳性,inl A、virR、dlt C、dlt D、mpr F存在缺失现象,其检测率分别为88.9%(16/18)、94.4%(17/18)、83.3%(15/18)、88.9%(16/18)、83.3%(15/18)。毒力基因缺失与血清型相关性分析结果显示,不同血清型缺失基因呈多样性。表明这8个毒力基因在市售鸡肉的单增李斯特菌中普遍分布。     

单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定

按照国家标准检测了4类肉制品中的361份样品。应用PCR方法检测了单增李斯特菌溶血素hly基因。分析单核细胞增生性李斯特菌在即食食品中污染情况。共检出20株单增李斯特菌,检出率为5.54%(20/361),主要污染来源是调理肉制品,污染率高达16.88%(13/77)。阳性菌株中含有溶血素基因的菌株有18株,占90%。表明被检测地区肉类食品中,致病性单增李斯特菌污染率较高。     

不同来源及血清型李斯特氏菌生长动力学参数比较

以不同来源、不同血清型李斯特氏菌(Listeria spp.)株(临床分离株7株、环境分离株7株和其他来源3株,11种血清型的17个ATCC标准菌株)为研究对象,研究其生长动力学与来源、血清型之间的关系,37℃静置培养条件下获得17株菌的生长曲线,并利用Baranyi模型对其拟合,得到每株菌的生长动力学参数———最大比生长速率(μmax)、延滞期(λ)、最大细胞浓度(ymax)。结果表明:μmax和λ这2个参数的最大值和最小值分别存在显著性差异(P<0.05),血清型为3a和4b的2株单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的延滞期存在显著性差异(P<0.05),血清型为6a和6b的2株英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)的最大比生长速率存在显著差异(P<0.05)。格氏李斯特氏菌(Listeria grayi)菌株与其他菌株存在显著性差异(P<0.05),其余不同来源的李斯特氏菌生长动力学差异不显著。     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

食品中单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患食源性致病菌,如何有效控制食品(尤其是即食食品)中的单增李斯特菌,是食品安全的重要任务,其中快速、准确的检测技术是关键因素之一.作者对单增李斯特菌的传统检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法进行综述,并对目前国内单增李斯特菌检测过程中所存在的问题进行探讨,以期为今后的研究提供参考.     

浙江省即食生鲜果蔬病原微生物污染调查分析

为调查浙江省即食生鲜果蔬病原微生物污染情况,在2018年6—10月随机抽取基地和市场环节的香瓜等10种即食果蔬品种共111个样品,采用国家标准方法分析香瓜和萝卜中大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌4种致病菌污染情况,以及生菜、黄瓜等8种果蔬中大肠埃希菌和蜡样芽孢杆菌的污染情况。结果显示,111份样品中检出食源性致病菌16份,检出率为14.4%,其中大肠埃希菌检出率为9%,蜡样芽孢杆菌检出率为5.6%,金黄色葡萄球菌检出率为4.8%。食源性致病菌检出率较高的样品多为超市、农贸市场环节样品,表明即食果蔬致病菌的污染易发生在采后环节。浙江省2018年即食生鲜果蔬中食源性致病菌污染对消费者健康存在潜在的安全隐患,需加强采后流通环节交叉污染防控,保障即食果蔬食品安全,防止食源性疾病暴发。     

单核细胞增生性李斯特菌mpl基因的克隆及其原核表达载体的构建

研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建.通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体.经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为1...     

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。     

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。     

含有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立含有扩增内标（IAC,Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin 基因和鸡的transforming growth factor 基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。     

基于气相离子迁移谱的羊肉掺伪快速鉴别方法

【目的】建立基于气相离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)的羊肉掺伪快速鉴别的新方法,为羊肉及其制品的品质评价和质量安全监管提供一种新方法。【方法】以市售新鲜羊肉、猪肉及鸡肉为试材,以空气作为空白样,以纯羊肉、猪肉及鸡肉作为样本对照,分别将猪肉、鸡肉按照5%、10%、15%、20%、25%、30%及40%的质量百分比模拟羊肉掺伪,采用GC-IMS直接对其特征成分进行检测,通过设备自带的LAV(Laboratory Analytical Viewer)分析软件中Reporter和Gallery插件程序构建挥发性有机物的差异图谱,并运用dynamic PCA plug-ins插件程序进行PCA处理。【结果】当羊肉中掺入猪肉比例大于5%时,芝麻酚、2-乙基-1-己醇、2-戊酮等5种特征风味含量的减少和正己醇、2,3-丁二酮、羟基丙酮等39种特征风味含量的增加均可用于羊肉中掺入猪肉的鉴别;当羊肉中鸡肉掺入比例达到10%时,3-甲硫基丙醛、正己醇、反-2-辛烯醛等46种特征风味物质含量的减少和丙醛等16种特征风味的增加均可用于羊肉中掺入鸡肉的鉴别。PCA主成分分析可明显区分羊肉中掺入不同比例的猪肉和鸡肉样本,且不同掺入比例组有其明显的归属区域。【结论】气相离子迁移谱检测方法可以对不同掺伪羊肉特征成分进行检测分析,该方法无需复杂前处理,操作简单,分析速度快,适用于羊肉掺伪的快速鉴别。     

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。     

陕西关中畜禽肉及凉拌菜中沙门氏菌污染分析

为了解陕西省关中地区食品中沙门氏菌的污染状况及分布,初步确定污染沙门氏菌的高危食品种类,为沙门氏菌检测、监测和食品安全控制提供理论依据。本研究按照GB/T 4789.1-2003规定的方法采集陕西省西安、杨凌和宝鸡等地超市和农贸市场的零售肉样品443份,凉拌菜样品209份;使用选择性培养基分离沙门氏菌,采用PCR技术对沙门氏菌进行鉴定。结果发现5大类食品中,鸡肉被沙门氏菌污染的状况最为严重(69.9%),其他食品污染率由高到低依次为羊肉(55.3%)、牛肉(30.1%)、猪肉(19.4%)和凉拌菜(9.6%);肉类食品的污染状况(45.2%)远高于凉拌菜(9.6%);从超市采集的零售肉样品沙门氏菌污染率(46.8%)低于从农贸市场采集的零售肉样品(54.6%);西安地区零售肉沙门氏菌污染率最高,其次分别为杨凌和宝鸡地区;杨凌地区即食凉拌菜沙门氏菌污染率最高(6.7%),其次分别为宝鸡(2.9%)和西安(0%)。从结果可得出,陕西关中地区的零售肉和即食凉拌菜已在不同程度上受到沙门氏菌污染。     

反复冷冻-解冻对猪肉品质特性和微观结构的影响

 【目的】反复冷冻-解冻对猪肉品质特性和微观结构的影响,为肉类保鲜提供科学依据。【方法】猪肉背最长肌经过反复冻结（-26℃,7 d）、解冻（18℃室温流水解冻）后,测定肌肉解冻损失(thawing loss, TL)、煮制损失（cooking loss,CL）、剪切力（cutting force,CF）、微观结构、肉的颜色（(L*,a*和b*值)）、硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）等指标。【结果】随着冷冻-解冻次数的增加,猪肉的TL、CL、TBARS、L*和b*值明显增大(P＜0.05),肌纤维排列混乱断裂、肌纤维间隙增大、结构疏松、肌内膜破裂,a*值逐渐变小;冷冻-解冻1次后猪肉CF明显高于新鲜猪肉,超过3次后,CF逐渐变小。【结论】反复冷冻-解冻过程严重破坏了肌肉微观结构、降低了猪肉品质。