牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。     

类弹性蛋白和内含肽融合表达纯化重组人防御素3

为建立简单、经济的重组人β防御素3(HBD3)制备方法,将HBD3序列插入类弹性蛋白(ELP)与△I-CM内含肽融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌,20℃下用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下进行相变循环,用内含肽自裂解活性释放目的蛋白,用琼脂扩散和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果表明:融合蛋白在重组菌中获得可溶性表达,第1轮相变循环的纯度为85.7%,再次相变循化的纯度达93.1%;内含肽裂解温度为28℃,孵育12 h裂解效率达90.3%;重组HBD3回收率达74.8%,产量为0.98 mg·L~(-1),纯度为92.6%,内毒素含量低于0.03 U·mg~(-1)(蛋白),对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌活性。说明基于ELP相变循化和内含肽自裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组}tBD3的规模化制备。     

大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。     

细胞核rDNA序列分析5种罗非鱼的亲缘关系

[目的]探索五种罗非鱼的亲缘关系。[方法]从尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、杂交种尼奥罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和红罗非鱼基因组中提取DNA,通过PcR扩增其ITS1基因序列及18S、5．8S部分序列并进行序列分析。[结果]扩增片段大小约700bp。测序结果显示获得的序列包括完整的ITSI区以及18S和5．8S部分序列。序列长度变异主要在ITS1区,18S和5．8S片段的序列长度没有发生变化。罗非鱼5个种的ITS1序列的碱基组成差别不大。从UPGMA聚类结果上看,尼罗罗非鱼与尼奥罗非鱼聚为一支;莫桑比克罗非鱼与奥利亚罗非鱼聚为一支,红罗非鱼再与莫-奥聚合。[结论]五种罗非鱼的ITS1及18S、5．8S部分序列分析结果表明,尼罗和尼奥罗非鱼亲缘关系较近,奥利亚与莫桑比克罗非鱼亲缘关系较近,红罗非鱼可能与奥利亚和莫桑比克罗非鱼有一定的亲缘关系。     

人防御素 hβD-3基因在大肠埃希菌中的融合表达

研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3蛋白的量为18.17μg/mL.经对大肠埃希菌K12D31的抑菌试验鉴定,肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD-3蛋白.     

斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。     

猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达

【目的】猪β-防御素(β-defensin)是猪自身分泌的一种能够杀菌、调节免疫功能的小分子抗菌肽,是猪生长繁殖不可缺少的蛋白质。【方法】根据NCBI数据库中的猪防御素cDNA序列,人工合成该基因序列,同时引入相关调控序列及适当酶切位点。酶切该人工合成的DNA后,连接到表达载体p HT43中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得的转化子用于筛选重组表达质粒。将获得的重组表达质粒p HT43-SS-BD转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N中,获得基因工程菌株。使用蔗糖诱导基因工程菌表达猪β-防御素,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,抑菌试验测定其抑菌活性。【结果】SDS-PAGE电泳结果显示在蔗糖诱导后得到约5 KDa的目的蛋白条带;平板抑菌试验结果表明,蔗糖诱导后的上清液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果,而没加蔗糖的对照组上清液无抑菌效果。【结论】该研究实现猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为解决抗菌肽来源限制及枯草芽孢杆菌的生产应用奠定了技术基础。     

荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析

 【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT－PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180 bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS－PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05 mg?mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。     

我国主要养殖罗非鱼的16S rRNA序列特征分析

对我国主要养殖的尼罗、奥利亚、莫桑比克、杂交种尼奥（尼罗♀×奥利亚♂）和红罗非鱼（莫桑比克×尼罗）的线粒体16S rRNA部分序列进行了PCR扩增和测序分析,探讨罗非鱼种间亲缘关系和种类鉴别标记。PCR产物经直接测序,5种罗非鱼中大部分个体均获得长546 bp的基因序列。其碱基组成GC含量为47.4%。序列比对分析显示变异位点18个,没有插入/缺失位点,转换/颠换比率为2.7。序列分析表明,红和奥利亚各有2个单倍型,尼奥、莫桑比克与尼罗各有1个单倍型。其中,尼奥与尼罗的单倍型序列相同,莫桑比克与红罗非鱼的1个单倍型序列相同。表明部分红罗非鱼的母本为莫桑比克。UPGMA聚类分析表明,尼奥与尼罗聚成一支、红罗非鱼与莫桑比克成一支、奥利亚独成一支。     

马属抗菌肽hepcidin在酵母系统中的表达与鉴定

根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279 bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验...     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约386 bp的目的序列GnRH/GAP,先将其克隆到T载体上,通过酶切鉴定、序列测定分析,确认序列的正确性后,将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH/GAP,再转化到大肠杆菌TB1中,经IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的相对分子量约56 000的融合蛋白。     

淇河鲫生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到淇河鲫(Carassius auratus gibelio var)的生长激素(GH)基因cDNA,其GenBank注册号为DQ350437.分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:克隆到的淇河鲫生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽.SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/LIPTG诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体.细菌裂解液沉淀溶于8mol/L尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量约为23.5kD的单一蛋白带.     

弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank中弓形虫表面抗原SAG3基因序列,以弓形虫总RNA反转录的cDNA为模板,扩增出SAG3去除信号肽基因并进行原核表达.将重组pET-28a(+ )-SAG3阳性表达质粒转入大肠杆菌BL(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.通过SDS- PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果表明:成功扩增了不合信号肽的SAG3基因,构建的原核表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,能够与鼠抗弓形虫阳性血清发生特异性反应,去信号肽的SAG蛋白具有反应原性.     

Bacterial Expression and Purification of an Active ω-Atracotoxin-Ar1b from Spider Atrax robustus

The ω-atracotoxin-Ar1b toxin(ω-ACTX-Ar1b)is one of the arthropod-selective peptide neurotoxins from the venom of Australian funnel-web spider Atrax robustus.The gene of Ar1b was synthesized and cloned into pET-32a(+)vector to allow expression of Ar1b as a fusion protein with thioredoxin and the His-tag(rTrx-Ar1b)in E.coli BL21(DE3).The optimal condition for inducing the expression of rTrx-Ar1b was 1.0 mmol L-1 IPTG for 6 h at 28℃.The fusion protein rTrx-Ar1b was expressed in soluble form and was purified effectively by His Trap HP affinity column and rpHLPC and a final yield of purified rTrx-Ar1b was 95 mg from 1000 mL E.coli culture.The LD50 values for Mythimna separate and Tenebrio molitor were 111.66 and 11.04 μg g-1 determined by injection of the purified rTrx-Ar1b.The results indicated that the recombinant Ar1b protein was successfully expressed in E.coli and it was high toxicity against tested insects.     

梅花鹿IGF-1的原核表达与纯化

【目的】克隆梅花鹿（Cervus nippon）胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列（登录号：HQ890468）设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Rosetta大肠杆菌进行诱导表达（0.6 mmol/L IPTG,37 ℃,4 h）后,对其表达产物进行SDSPAGE和Western blotting检测。用Ni-Agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白,并利用四唑盐比色法（MTT法）和流式细胞仪检测目标蛋白对NIH3T3细胞增殖及不同细胞周期下NIH3T3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿IGF1成熟肽基因序列（234 bp）;经鉴定,原核表达载体pET-32a-IGF-1构建成功;SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在Rosetta中成功诱导表达了融合蛋白,且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高;MTT法和细胞周期检测结果表明,复性后的IGF-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】 成功克隆了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列,获得了具有生物学活性的IGF-1蛋白。     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

黑曲霉果胶裂解酶基因的克隆与原核表达

根据NCBI上果胶裂解酶(PL)基因在黑曲霉基因组上的分布特点设计特异引物,通过重组PCR扩增出黑曲霉编码PL的结构基因。将PL基因连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-PL,转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,用IPTG进行诱导表达。结果表明,PL基因片段序列全长1 431bp,与已知PL基因(XM_001397206.2)核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。表达产物经12%SDS-PAGE电泳,得到了一条大小约为50kD的条带,与预期分子量相符,证明真菌PL基因在E.coli BL21中可以有效表达。