斯氏艾美耳球虫ADF基因部分序列的克隆与分析

为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。     

3种兔球虫ITS-1序列测定与系统发育分析

从河北省兔场分别单卵囊分离孢子化大型艾美耳球虫卵囊、黄艾美耳球虫卵囊及肠艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔后获得纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18SrDNA和5．8SrDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫ITS-1片段,产物纯化后测序。将3种球虫ITS-1测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离比较,绘制系统发育树。结果表明,大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株分别扩增出424、455、434bp的ITS-1片段。大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾关耳球虫河北株与GenBank中发布的同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为97．4％、97．9％和96．9％。系统发育树显示兔球虫ITS-1序列形成1个单系群,该单系群根据寄生部位分为2个姊妹群。     

柔嫩艾美耳球虫河北株SOSO7基因克隆与序列分析

为分析柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株SO7基因序列遗传变异性,试验根据GenBank发表的SO7序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆出柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因,将SO7基因克隆入pMD18-T载体中,进行测序、序列分析及表达蛋白结构的预测。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因编码215个氨基酸,具有一个开放阅读框,大小为645 bp;与GenBank中发表的美国分离株(LS18)、扬州分离株(YZ)、海南分离株(HN)、广东分离株(GD)、北京分离株(BJ)SO7核苷酸序列的同源性分别为99.4%、99.5%、99.7%、99.5%、99.4%,所推导的氨基酸序列的同源性分别为98.6%、99.1%、99.1%、98.6%、98.1%。从进化关系来看,同种间SO7基因相比,柔嫩艾美耳球虫河北株与HN株同属一个分支,遗传关系较近;与GD株、BJ株的遗传关系相对较远。蛋白结构预测显示蛋白的相对分子质量为52.20 ku,理论等电点(PI)为5.08,不稳定系数为52.73,为不稳定蛋白;在1~20个氨基酸具有信号肽;有5个疏水位点;没有跨膜结构。综上所述,柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因序列遗传变异性不明显,可以作为构建核酸疫苗候选基因。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

黄艾美耳球虫河北株18SrDNA部分序列测定及系统发育分析

为了进一步确定黄艾美耳球虫河北株虫种,试验根据GenBank中发表的黄艾美耳球虫18SrDNA基因序列设计引物,建立PCR方法对黄艾美耳球虫河北株基因片段扩增、测序,并进行系统发育分析.结果表明:扩增出大小为1 465bp的清晰条带;黄艾美耳球虫河北株18S rDNA序列测定结果与GenBank中的黄艾美耳球虫EF69...     

鸡六种艾美耳球ITS-1的克隆和序列分析

为对上海地区分离的6种鸡艾美耳球虫内转录间隔区1(ITS-1)进行克隆和序列分析,探索ITS-1区域序列在鸡球虫分类学中的作用,利用一对属特异性引物,对上海地区分离的6种球虫的ITS-1序列进行PCR扩增,扩增产物克隆到pMD18-T后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行系统进化树分析.结果显示,巨型艾美耳球虫有大小分别为547bp和422bp两条PCR扩增条带;和缓艾美耳球虫有大小为627bp和493bp两条PCR扩增条带;其他4种球虫均为一条PCR扩增条带,大小分别为柔嫩艾美耳球虫668bp,毒害艾美耳球虫691 bp,堆型艾美耳球虫507 bp,早熟艾美耳球虫541 bp.6种球虫序列之间的同源性为34%～52%.系统进化分析显示,各个种分别与GenBank中下载的对应球虫种在同一分支上.     

柔嫩艾美耳球虫江苏株微线蛋白-3基因的克隆与序列分析

柔嫩艾美耳球虫微线蛋白-3(EtMIC3)不仅在虫体侵入中起关键作用,而且还决定了球虫侵入部位特异性。为克隆柔嫩艾美耳球虫江苏株的EtMIC3基因,根据GenBank上登录的EtMIC3基因序列设计特异性引物,以子孢子总RNA为模板,用RT-PCR的方法扩增EtMIC3的cDNA序列,将其与pMD19-T连接后送至上海英骏生物技术有限公司测序并进行序列分析。结果表明EtMIC3的开放阅读框(ORF)为2 967 bp,编码988个氨基酸,与GenBank上的EtMIC3基因(登录号:FJ374765.1)比较,核苷酸同源性为99%,推导的氨基酸序列同源性为99%。本研究为揭示柔嫩艾美耳球虫入侵和寄生部位特异性的分子机制提供基础,也为柔嫩艾美耳球虫新型疫苗的研制提供候选抗原。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究EtMIC3基因遗传变异情况。结果获得2976 bp的目的片段,各株与FJ374765.1 CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株SO7基因的克隆与序列分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)HN株SO7基因的遗传变异情况,根据Gen Bank发表的SO7基因的c DNA序列(登录号:X15898)的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫HN株总RNA中扩增SO7基因,将扩增产物与p MD18-T载体连接后进行测序和序列分析,并与已发表的相关序列进行比较,分析SO7基因的遗传变异情况。结果获得673 bp的目的片段,HN株的SO7基因序列与已发表国内外虫株的SO7基因序列相比,核苷酸有7个位点发生了变化,引起4个位点的氨基酸发生改变,其中有3个位点的变化未引起相应的氨基酸发生改变。系统发育树分析表明,同种间HN株SO7基因与YZ株的遗传关系最近。     

巨型艾美耳球虫合肥(HF)株的分离与鉴定

本试验采用形态学方法分离合肥地区鸡体内巨型艾美耳球虫卵囊,通过雏鸡进行单卵囊感染与扩增试验,用PCR方法扩增该分离株的ITS-1基因序列,并与巨型艾美耳球虫相关序列进行比对、构建系统进化树,从而确定合肥地区巨型艾美     

基于ITS-1序列的5种兔球虫系统进化分析

利用核糖体DNA内转录间隔区1(ITS-1)序列对兔艾美耳球虫进行系统进化分析,并探讨生物学和形态学特征在兔球虫进化中的意义。单卵囊分离大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔获得纯种卵囊,CTAB法提取卵囊基因组DNA,PCR扩增ITS-1区后克隆、测序。将测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离分析,绘制系统进化树。结果显示:大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫河北株ITS-1序列分别长320、330、351、336和341bp。5种兔球虫河北株与GenBank中同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为96.9%、97.3%、96.9%、99.1%和99.4%。兔球虫形成单系群,该单系群分为2个姐妹谱,与卵囊残体有无相对应,其它形态学和生物学特征与系统进化无相关性。研究结果表明外残体的有无可作为兔球虫进化分类的特征。     

鸡柔嫩艾美耳球虫YL株多次传代后的致病性研究

为研究多次传代后的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)YL株的致病性,分别以不同剂量的36代次柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,通过临床症状、死亡率、血便程度、潜隐期、盲肠病变、平均增重及每克粪便卵囊数(OPG)对其致病性进行评价.结果显示,不同剂量孢子化卵囊感染雏鸡均在感染后3d～4d出现血便,球...     

利用单孢子囊接种技术建立鸡柔嫩艾美耳球虫克隆

利用显微操作从柔嫩艾美耳球虫长春株、河北株、山东株(由单卵囊接种建立)挑选出单孢子囊接种于雏鸡,接种成功率为17.8%。传代后提取DNA,用7条随机引物PCR扩增,鉴别RAPD图谱及特异条带,结果获得柔嫩艾美耳球虫长春株2个克隆、河北株2个克隆、山东株1个克隆。     

柔嫩艾美耳球虫MIF基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柔嫩艾美耳球虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)基因CDS区,探究其生物信息学特征,为后续抗原表位筛选提供理论依据。【方法】采集晋中地区疑似柔嫩艾美耳球虫感染的阳性样本进行PCR鉴定,根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫MIF基因序列,利用RT-PCR技术扩增MIF基因CDS区,构建pET28a-EtMIF重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析;利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、结构和功能等进行预测。【结果】成功克隆了柔嫩艾美耳球虫MIF基因CDS区序列,全长348 bp,共编码115个氨基酸,相对分子质量为1.203×10⁴。系统进化树结果表明,柔嫩艾美耳球虫MIF基因氨基酸序列与毒害艾美耳球虫的亲缘关系最近,相似性为98.3%。MIF蛋白为非跨膜、可溶性、非分泌型蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,共有10个磷酸化位点;含有1个保守结构域,二级结构由无规则卷曲(35.65%)、延伸链(30.43%)、α-螺旋(27.83%)和β-转角(6.09%)组成,...     

多重PCR检测3种鸡球虫方法的建立

根据GenBank中发表的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫TS-1序列,设计了3对引物,建立了这3种球虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了研究,对巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的混合卵囊进行了初步应用.结果显示:单一PCR和多重PCR均能扩增出巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫特异性条带,其大小分别为151 bp、463 bp、303 bp,其最小检测浓度为0.5ng,对水牛梭形肉孢子虫、有毒艾美耳球虫、猪源弓形虫汤山株及其田间分离株均不起反应,表明建立的方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可望用于巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的诊断和田间种类调查.     

鸡柔嫩艾美耳球虫HBCL株的分离鉴定与致病性检测

为了确定引起雏鸡死亡的病原和其致病性,从病死雏鸡的盲肠内分离病原,通过临床症状、显微镜检查、PCR检测、半数致死量(LD50)的测定等方法进行鉴定。结果表明:初步确定分离到的球虫为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),并命名为HBCL株;用PCR法对HBCL株基因序列进行扩增,结果HBCL株基因序列与E.tenella同源性为100%,证实了球虫HBCL株为E.tenella;E.tenella HBCL株对雏鸡的致病性较强,半数致死量(LD50)为3.07×104个卵囊/只。说明分离的E.tenella HBCL株具有很强的致病性。     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况.结果每个虫株均获得572 bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%.本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础.     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的扩增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况。结果每个虫株均获得572bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%。本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫沈阳分离株Mic2基因的克隆及序列分析

<正>随着分子生物学技术的快速发展,国内外均已经克隆出了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白2(Mic2)基因[1-2]。为了进一步明确沈阳地区分离株柔嫩艾美耳球虫Mic2基因与其他地区分离株Et Mic2基因之间的序列相似性,本试验从沈阳地区分离到的柔嫩艾美耳球虫中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出Et Mic2基因,将其插入克隆载体p EASY-T1,对Mic2