Real—time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法.通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高.通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率.     

虾桃拉病毒、黄头病毒和白斑病毒液相芯片快速检测方法的建立

本研究通过设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针并标记生物素,利用该探针与荧光编码微球偶联后与虾黄头病毒(Yellow head virus,YHV)、虾桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)和白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Luminex200)检测荧光信号,初步建立了虾黄头病毒、桃拉病毒和白斑病毒的快速同步检测方法。结果显示,建立的该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虾病病毒基因反应,YHV、TSV和WSSV检测灵敏度高分别为401.5、251.5和75.2 copies。     

荧光定量RT-PCR检测虾Taura综合征病毒方法建立及应用

由Taura综合征病毒（TaurasyndromevirusTSV）引起的虾Taura综合征（Taurasylldrome）是世界动物卫生组织（OIE）规定的必需上报的水生动物二类疫病。本研究采用Taqman探针技术建立了快速检测TSV的荧光定量RT—PCR方法，通过常规RT—PCR方法对比，证实其检测灵敏度和阳性检出率明显提高。     

鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

鸭圆环病毒病给养鸭业造成严重的经济损失,鉴于此,本研究根据GenBank登录的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)保守区基因组序列(登录号:NC_005053.1),设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性;第1轮扩增的灵敏度为10 pg,第2轮扩增的灵敏度为0.1 pg,通过巢式PCR,敏感性提高了100倍。本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于鸭圆环病毒的病原检测。     

对虾桃拉综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立一种敏感、定量、快速、特异、安全的实时荧光定量PCR检测方法,用于对虾桃拉综合征病毒(TSV)的早期诊断和监测.方法:从GeneBank下载所有Taura病毒的序列,用生物软件进行序列比对,在TSV保守区序列设计特异性引物和探针.对实时荧光定量PCR反应条件进行优化,提高特异性和灵敏度.结果:检测灵敏度达450个病毒拷贝,超过普通PCR100倍;检测特异性为100%,高于普通PCR;检测时间在60 min内,约为普通PCR的1/4;有效解决PCR产物的气溶胶污染问题,安全性高.结论:本研究应用荧光定量PCR技术用于对虾桃拉综合征病毒检测具有敏感、定量、快速、特异、安全等优点.     

猪伪狂犬病病毒套式PCR检测方法的建立与应用

对伪狂犬病病毒(PRV)国标PCR方法进行优化,建立一种高灵敏度的套式PCR方法。根据伪狂犬病病毒gD基因序列,设计并合成了2对引物,通过反应体系和条件的优化建立套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等验证建立方法的适用性。结果表明,建立的方法检测伪狂犬病病毒DNA的极限为2.6×10-7 ng/mL,灵敏度比国家标准方法提高了1 000倍,从疑似PRV感染组织病料中能大幅度提高阳性检出率。本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的快速检测猪伪狂犬病病毒的套式PCR检测方法。     

二温式PCR检测对虾白斑综合征病毒

本研究设计了一对能扩增大小为306bp对虾白斑综合征病毒(WSSV)某段基因的特异性引物，优化建立了能快速检测WSSV的二温式PCR，在对包括105份临床样品、10份SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原在内的样品检测结果中，有65份临床样品呈现WSSV阳性，而10份SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原的PCR结果为阴性。该二温式PCR最低能检测到1pg的WSSV感染对虾组织样品总DNA。这些结果表明，该PCR具有高度的特异性和敏染性。     

多重PCR结合基因芯片技术检测5种猪繁殖障碍性病毒病方法的研究

为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。     

多重PCR结合基因芯片技术检测5种猪繁殖障碍性病毒病方法的研究

为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。     

PCR结合核酸斑点杂交检测猪伪狂犬病毒

本研究基于猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gE基因,建立了一种PCR结合核酸斑点杂交检测方法来鉴别野毒株和疫苗株,并利用这一方法对山东省部分地区的猪临床病料中PRV进行了检测。结果显示,建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法只与PRV野毒株反应,而与PRV gE基因缺失疫苗、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒2型不反应。PCR结合核酸斑点杂交方法在53份病料中检出PRV阳性病料5份,阳性率为9.43%,高于单纯PCR的检出率(7.55%)。结果表明,本研究建立的PCR结合斑点杂交的方法特异性强,灵敏度高,适合PRV野毒的检测以及流行病学调查,可应用于PRV的鉴别诊断和净化。     

对虾白斑综合症病毒变性高效液相色谱检测方法的建立与应用

据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。     

EHP、SHIV双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针.建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测.结果表明:该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green r...     

Rapid diagnosis of vibriosis and white spot syndrome (WSS) in the culture of shrimp, <Emphasis Type="Italic">Penaeus monodon</Emphasis> in Philippines

Viral and bacterial pathogens have raised serious concerns in the sustainability of the shrimp culture industry in the Philippines. Heavy mortality associated with luminous vibriosis and white spot syndrome virus (WSSV) infection has been the major problem besetting the industry. Using published PCR protocols for the diagnosis of vibriosis and white spot syndrome virus (WSSV) disease in shrimp, we optimized these assays that could be suited to the shrimp aquaculture setting in the Philippines. Genomic DNAs of Vibrio spp. that exhibited luminescence as well as those that grew on thiosulfate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) were used for the PCR amplification of the ribonuclease P (RNase P) gene. There was differential amplification of the RNase P gene based on the phenotypic characters of the Vibrio spp. Similar results were also obtained using direct colony PCR of the bacterial colonies. White spot syndrome virus was also detected in the infected shrimp and there were differences in the detection frequency in relation to the tissues used for PCR amplification. Duplex PCR was also optimized that could be used for simultaneous detection of these pathogens in shrimp.     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的24株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株和5株PRRSV经典毒株的保守区基因序列,使用PrimerExpress 3.0软件设计并合成实时荧光定量PCR（Real-timeFluorescent Quantitative PCR,Real-time FQ-PCR）用引物和探针,建立了Real-time FQ-PCR检测方法以鉴别检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。用建立的检测方法对已定量的10倍倍比稀释的质粒pGET-258为标准品进行检测,并与常规PCR进行比较。结果显示,该Real-time FQ-PCR方法敏感度可达1.5个拷贝,比常规PCR敏感度高100倍,且批内和批间重复性检测结果的变异系数均小于2%。用该方法与常规PCR方法及病毒分离方法对18份临床样品进行对比检测,显示该方法灵敏度高、成本低,并且能够对样品中病毒进行定量,为高致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测方法的建立

为建立牛新孢子虫的快速准确检测方法,根据犬新孢子虫种属特异性基因Nc-5序列,设计高度保守的引物和荧光探针,通过引物设计和搭桥PCR法扩增,获得Nc-5荧光PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测体系。该方法具有较好的特异性;可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当;通过对系列稀释的核酸样品的重复性检测,变异系数为0.50%～1.30%。通过对58份临床样品分别用该方法、不含内标的荧光PCR方法和普通PCR方法检测,结果显示,该方法与不含内标的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7.0%）高;表明该方法可用于临床样品中牛新孢子虫的快速检测,并能对实验室进行质量控制。     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...