PRRSV感染Marc-145 细胞凋亡的形态学观察

研究PRRSV感染与细胞凋亡的关系及调亡的可能机制将有助于人们认识PRRSV感染性的发生、发展及转归机制,为进一步阐明PRRSV的致病机制和该病的防治提供一些新的思路.     

通过抑制caspase-8活性提高PRRSV体外培养滴度的初步研究

探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制,从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞,并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK)分别处理PRRSV感染细胞,通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID₅₀)来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示：z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂,10 μmol/L为最佳使用浓度,PRRSV感染细胞48 h后加入10 μmol/L Z-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外,PRRSV感染Marc-145细胞后,细胞caspase-8活性显著增加,且随着感染时间的延长,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势,而抑凋亡因子B...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导细胞凋亡的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）感染主要引起怀孕母猪的早产、流产、死胎及仔猪的呼吸系统症状，引起感染猪对其他致病因子的易感性增加，出现免疫抑制和亚临床感染等特点。根据病毒基因组差异可将PRRSV分为欧洲型和美洲型2个基因型，分别以LV株和ATCC-VR-2332株为代表。研究发现，PRRSV的这2种基因型均可在体内外诱导细胞凋亡，且诱导机制可能与病毒致病机制有关。红胞凋亡（Apoptosis），是指细胞在一定的生理或病理条件下遵循自身的程序自己结束生命的过程，最后细胞脱落、离体或裂解为若干凋亡小体，而被其他细胞吞噬。现对近年来猪繁殖与呼吸综合征病毒及其一些基因产物对宿主细胞凋亡的作用作以下综述。     

TUNEL法检测PRRSV感染Marc-145细胞凋亡的研究

为了研究PRRSV诱导Marc-145细胞凋亡的动态变化规律，收集PRRSV-SC1株感染Marc-145细胞后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和相同时间点未接种病毒的细胞样品，采用TUNEL法进行细胞凋亡的检测。结果表明，PRRSV能诱导Marc-145细胞发生凋亡；在PRRSV感染后24h开始出现凋亡，48h凋亡更加明显，72h达到高峰，随后细胞凋亡水平又有所下降，在感染后144h，细胞的凋亡水平低于正常组。     

c-Jun氨基末端激酶的激活在猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的细胞凋亡和病毒复制中的作用研究

宿主细胞凋亡在病毒感染发病过程中起着至关重要的作用。MAPK激酶,尤其是应激活化蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶(SAPK/JNK)和p38往往参与病毒介导的细胞凋亡。研究证实,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染在体内和体外都会导致宿主细胞的凋亡。本研究旨在确定应激活化蛋白激酶JNK和p38在PRRSV感染诱导的细胞凋亡中是否发挥作用。对JNK和p38磷酸化的检测发现,在PRRSV感染应答中,JNK被激活,而p38没有被激活。应用特异性抑制剂研究这个激酶对细胞凋亡诱导和病毒复制的影响,研究结果发现,JNK抑制剂SP600125引起的JNK抑制能阻断PRRSV介导的细胞凋亡,但并不抑制病毒的复制。进一步研究结果表明,ROS的产生参与了JNK的活化,Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xl是JNK介导细胞凋亡的下游靶标。因此,JNK信号通路的激活是PRRSV介导的细胞凋亡所必需的,但并非病毒复制所必需。     

人工感染PRRSV仔猪肺和子宫细胞凋亡的电镜观察

应用透射电子显微镜对仔猪感染猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后不同时期肺和子宫凋亡细胞的超微形态结构进行了观察。结果表明，PRRSV可诱导宿主肺和子宫发生典型的细胞凋亡，表现为细胞的超微形态结构随着病毒感染进程出现不同的特征性变化，早期(感染后第8h至第3d)凋亡细胞多表现为细胞体积缩小，细胞质密度增强，染色质浓缩，核仁解体，内质网扩张；中期(感染后第5d至第9d)凋亡细胞体积显著缩小，细胞膜突起，线粒体增多，有凋亡小体形成；晚期(感染后第10d以后)凋亡细胞形态多表现为凋亡小体降解和消失，少数凋亡细胞在凋亡晚期表现为坏死细胞。肺细胞凋亡主要发生于肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞，子宫细胞凋亡主要发生于子宫内膜细胞和内膜腺细胞。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与免疫抑制(续)

2 PRRSV 对细胞的影响 2．1 PRRSV 引发的细胞凋亡近来研究发现由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5编码的糖蛋白 GP5在 cos—1细胞表达时能诱导体外培养的细胞发生细胞凋亡。Sur 等(1997,1998)研究发现     

猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的缺失第3外显子的肿瘤坏死因子受体介导细胞凋亡能力的探究

肿瘤坏死因子受体(TNFR)可以在肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员的作用下引起受体介导的细胞凋亡。为了探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和TNFR介导的细胞凋亡的关系,首先使用GenBank中发表的猪源TNFR1的序列设计并合成针对TNFR1的特异性引物,然后检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后TNFR1的表达情况。结果表明,在PRRSV感染的PAM细胞中,有两种分子量不同的TNFR1存在,序列测定分析表明,一种为野生型TNFR1,另一种为第3外显子缺失(129 bp)的TNFR1(TNFR1-d3)。为探究缺失型TNFR1-d3在细胞凋亡中的意义,我们采用过表达的方法将携带TNFR1和TNFR1-d3的真核表达载体分别转染于HEK293细胞中,用TNF-α结合放线菌酮共刺激细胞诱导凋亡。通过流式细胞术检测发现,与野生型TNFR1相比,TNFR1-d3不再具有促进细胞凋亡的功能,说明缺失的第3外显子参与调控TNF-α诱导的细胞凋亡。本研究阐明了PRRSV和细胞凋亡的新机制。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对外周血单个核细胞凋亡细胞因子mRNA表达的影响

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductine and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用real-time PCR技术对外周血单个核细胞(PBMC)中的病毒栽量以及Fas、FasL、TNFR1和TNF-α等凋亡细胞因子mRNA表达水平进行检测,采用流式细胞术对PBMC的凋亡比率进行检测.结果显示,PRRSV/PCV2共感染组PBMC中PRRSV和PCV2载量、PB-MC凋亡比率均显著高于PRRSV感染组或PCV2感染组.所有病毒感染组的Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的mRNA表达水平均显著上调,并且PRRSV/PCV2共感染组的表达水平均显著高于单感染组.结果表明,Fas/FasL、TNFR1/TNF-α表达水平的显著上调可能在PRRSV和PCV2协同诱导凋亡机制中扮演重要角色.     

细胞凋亡与病毒的搞细胞凋亡

病毒的侵入可引起机体主细胞的凋亡，细胞凋亡有利于机体清除感染的细胞，保护自身免受病毒的侵害，是机体对病毒侵入的防缺机制之一。一些病毒具有许多抗细胞凋亡和抗CTL活性的机制，如编码免疫调节分子和调亡调节分子，降低细胞凋亡基因的表达以延长感染细胞的存活期，以利于病毒的增殖，现对细胞凋亡及病毒抗细胞凋亡的机制进一综述。     

茶皂素对PRRSV感染Marc-145细胞受体表达及Caspase-9活化的影响

以茶皂素(Teasaponin,TS)作为候选药物,研究茶皂素对Marc-145细胞受体CD163和波形蛋白(Vimentin)基因合成和蛋白表达的影响,以及茶皂素是否能通过细胞凋亡内源性通路影响PRRSV感染细胞,探究茶皂素抗PRRSV的作用机制。通过qRT-PCR和Western blot检测TS对细胞受体CD163和Vimentin的基因合成和蛋白表达的影响。运用Western blot技术检测TS对细胞内源性凋亡通路启动子caspase-9活化的影响,初探TS的抗PRRSV机制。qRT-PCR结果表明TS能显著抑制感染PRRSV的Marc-145细胞受体CD163和Vimentin基因的合成。Western blot结果表明TS能显著抑制细胞受体CD163和Vimentin的蛋白表达。TS能够引起细胞内源性凋亡通路启动子caspase-9的活化。研究表明,TS能抑制PRRSV在Marc-145细胞上的穿入过程,从而达到抗PRRSV的作用;亦可通过激活细胞凋亡内源性通路以早期促进细胞凋亡的方式产生抗PRRSV的作用。     

Reduction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in swine alveolar macrophages by porcine circovirus 2 (PCV2)-induced interferon-alpha

Two common viral pathogens of swine, namely, porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), were investigated in regard to their effects on monolayer cultures of swine alveolar macrophages (AMs). The purpose was to identify selected cellular changes and responses potentially associated with the clinical reactions of pigs infected with either or both of these viruses. Measurements included the (1) absolute and relative numbers of infected, viable, and apoptotic cells; (2) distribution of viral antigens; (3) levels of interferon-alpha (IFN-alpha) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) produced and their association with the extent of virus-induced cytopathology. Four groups of AMs were studied, including mock-infected, PCV2 alone-infected (PCV2-A), PRRSV alone-infected (PRRSV-A), and PCV2 and PRRSV dually infected (PCV2/PRRSV) groups. The AMs of PCV2-A group had high antigen-containing rate without cell death. There was a marked increase in cell death and apoptosis in PRRSV-A group. However, a lower PRRSV-induced infectious rate, cell death, and apoptosis were seen in PCV2/PRRSV group. High levels of IFN-alpha production were detected in PCV2-infected groups, but not in mock-infected and PRRSV-A groups. The PRRSV-induced cytopathic effect (CPE) on MARC-145 cells or swine AMs was markedly reduced by pre-incubation of the cells with UV-treated or non-UV-treated supernatants of PCV2-infected AMs. In addition, the reduction in CPE was abolished when the supernatants of PCV2-infected AMs were pre-treated with a mouse anti-recombinant porcine IFN-alpha antibody. The results suggest that swine AMs were an important reservoir of PCV2; PCV2 infection reduced PRRSV infection and PRRSV-associated CPE in PCV2/PRRSV AMs; the reduction of PRRSV infection in AMs was mediated by IFN-alpha generated by PCV2 infection. The reduced PRRSV-associated CPE in AMs and increased pro-inflammatory cytokine production may lead to a more severe pneumonic lesion in those dually infected pigs.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要是通过与宿主细胞表面的特异性受体结合,利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。作者对猪繁殖与呼吸综合征病毒相关受体的研究进行了综述,迄今已报道了5种独立的但功能相关的受体:硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、波形蛋白、CD163和非肌肉肌动蛋白ⅡA。对受体的功能特性进行研究,将为PRRSV的感染机理和病毒性疾病的预防和治疗具有重要的意义。     

转录组测序技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能导致母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难等症状,严重威胁全球养猪业的健康发展。目前,PRRSV的致病机制及其与宿主的互作机理并不完全清楚。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,转录组测序技术已被广泛应用于PRRSV的研究中,为深入解析PRRSV的致病机理及其与宿主的互作机制提供了一种全新的研究工具。作者从感染应答、蛋白功能、毒株、疫苗、抗病品种5个方面对近年来转录组测序技术在PRRSV研究中的应用进行了综述分析,对其筛选的差异表达基因(DEGs)和通路进行总结,以期为未来PRRSV转录组学研究提供参考。     

Differential host cell gene expression regulated by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP4 and GP5 glycoproteins

The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) GP4 and GP5 proteins are two membrane-associated viral glycoproteins that have been shown to induce neutralizing antibodies. In the present study, the host cell gene expression profiles altered by the GP4 and GP5 proteins were investigated by the use of DNA microarrays. Sublines of Marc-145 and HeLa cells were established by stable transfection with open reading frame (ORF)4 and ORF5 of PRRSV, respectively, and differential gene expressions were studied using microarray chips embedded with 1718 human-expressed sequence tags. The genes for protein degradation, protein synthesis and transport, and various other biochemical pathways were identified. No genes involved in the apoptosis pathway appeared to be regulated in GP5-expressing cells. The microarray data may provide insights into the specific cellular responses to the GP4 and GP5 proteins during PRRSV infection.     

Pathogenesis of type 1 (European genotype) porcine reproductive and respiratory syndrome virus in male gonads of infected boar

The objective of this study was to determine the pathogenesis of experimental infection with a type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by defining the sites of viral replication and apoptosis in male gonads from infected boars for a period of 21 days after intranasal inoculation. Microscopically, hypospermatogenesis and abundant germ cell depletion and death were observed in the testes. Such germ cell death occurs by apoptosis, as determined by a characteristic histological patterns and evidence of massive DNA fragment detected in situ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) reaction. PRRSV was detected in the testicular tissue of infected boars only. Viral nucleic acid was localized in spermatogonia, spermatocytes and spermatids but not in the vesicular and bulbourethral gland. In serial sections, PRRSV-positive cells did not co-localized with apoptotic cells. TUNEL-positive apoptotic cells were more numerous than PRRSV-positive cells in testicular sections. The present study demonstrated that type 1 PRRSV infects the spermatogonia and their progeny, and induces apoptosis in these germ cells.     

不同CSF免疫状态下猪PRRS易感性及IFN-γ分泌细胞应答

采用酶联免疫斑点检测技术（ELISpot）检测自然状态下猪外周血单核细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的细胞数,并用带T细胞表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）特异性小分子多肽刺激培养的PBMC,观察IFN-γ的分泌变化。结果显示,猪瘟病毒（Classical fever virus,CSFV）抗体阳性组中感染PRRSV比率小于CSFV抗体阴性组。CSFV抗体阳性猪PBMC中IFN-γ分泌细胞数量均高于CS—FV抗体阴性组,CSFV抗体阴性且受PRRSV感染猪的PBMC对PRRSV多肽刺激不应答。结果表明,对CSFV疫苗应答好的猪对PRRSV感染有一定的抵抗,其细胞免疫处于活动状态,提示2种传染病的免疫应答机理有部分相关性。     

PRRSV感染仔猪肾组织的超微病理变化分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是能引起仔猪高死亡率的疾病,给养猪业带来极大的经济损失。本研究对PRRSV感染仔猪肾组织的病毒定位及产生的超微病理变化进行观察,以期了解PRRSV对肾组织细胞以及血液循环的影响。主要采用透射电镜技术结合血清生化检测、免疫组织化学染色（IHC）,对仔猪感染PRRSV后肾组织进行超微病理学观察及分析。结果发现,PRRSV感染后引起肾组织损伤,病毒主要分布于肾小球、坏死的肾小管上皮细胞胞质及巨噬细胞胞质内;肾小球内足细胞足突广泛融合或微绒毛化,内皮细胞肿胀;肾小管上皮细胞线粒体肿胀、嵴断裂、溶解;间质炎性细胞浸润。PRRSV通过巨噬细胞内复制随血液扩散至肾组织,引起损伤;根据透射电镜观察结果,足细胞足突融合,肾小球血管内皮细胞损伤引起微血栓形成,说明PRRSV感染仔猪后影响了肾小球滤过率,同时,对肾血液微循环系统造成损伤。本研究为阐明PRRSV的感染致病机制提供理论基础。