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《中国兽医学报》2020,(8)
为建立山羊副流感病毒3型ELSIA抗体检测方法,利用DNAStar生物信息学软件对山羊副流感病毒3型NP蛋白抗原区域进行预测,利用Primer 6.0软件设计合成1对引物,通过RT-PCR技术扩增到807 bp基因片段,将其连接到原核表达质粒pET28a(+)中,成功表达了相对分子质量约39 000的目的蛋白,以纯化后的蛋白为包被抗原,建立检测山羊副流感病毒3型的ELISA抗体检测方法,并对方法的敏感性、特异性、稳定性进行了验证。结果显示,建立的方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点;对送检的745份临床羊血清进行检测,总阳性率为14.5%。本试验建立的间接ELISA检测方法为山羊副流感病毒3型抗体的快速检测及流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
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甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒检测基因芯片的制备与初步应用 总被引:2,自引:0,他引:2
建立DNA微列阵技术检测甲型H1N1和季节性H1N1流感病毒的方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。通过生物医学数据库甲型H1N1流感病毒及季节性H1N1亚型流感HA与NA基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证。试验所设计的探针可以对甲型H1N1流感与季节性H1N1流感病毒进行区分,用该方法检测了长春市CDC送检的6份疑似甲型H1N1流感病毒临床病例,4份阳性,检测结果同实时荧光定量PCR方法一致。结果表明,利用本研究建立的DNA微列阵技术检测甲型H1N1流感病毒方法,特异性和敏感性强,可作为甲型H1N1流感病毒临床标本检测方法。 相似文献
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旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。 相似文献
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检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法. 相似文献
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为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12.相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位.选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化.结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5 μg/mL,变异系数小于6%.利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100%.本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测. 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(4)
为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况,需要建立一种检测抗体的间接ELISA方法。采用纯化后EHV-1 XJ2015株的gG蛋白作为检测抗原,优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比。结果表明,该方法仅与EHV-1阳性血清发生反应,不与马疱疹病毒4型、马流感病毒和马动脉炎病毒阳性血清发生反应,血清稀释1∶1 600后,仍可以检测到阳性,组内及组间变异系数均小于5%。与试剂盒进行检测结果比较,符合率为93.35%。建立了EHV-1 gG蛋白间接ELISA检测方法,可为EHV-1的快速诊断、流行病学调查及防控工作提供技术支撑。 相似文献
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采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法.应用建立的方法分别对人、禽、猪以及马流感病毒核酸进行检测,结果显示,建立的方法通用性良好,可有效检测和鉴别H1和H3亚型流感病毒,但对其他亚型的流感病毒以及新城疫病毒核酸检测结果为阴性,表明建立的方法特异性强.进一步经体外转录制备了猪流感病毒H1和H3亚型HA完成编码区的核酸标准品cRNA,经稀释、分装、定量、均匀性和稳定性检验后,作为方法的质控品对建立的方法进行评价,结果表明,所建立的双重短探针实时RT-PCR方法灵敏度可达2.0×102拷贝/反应.在对586份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足动物流感病毒H1/H3亚型的早期快速检测的需求. 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(6)
为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL~101.57 ng/mL时与OD_(450nm)呈良好的线性关系,相关系数R~20.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。 相似文献
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为了建立检测H3N8亚型马流感病毒的RT-LAMP方法,根据H3N8亚型马流感病毒HA基因序列,设计了2对LAMP引物,经过优化反应条件,建立了RT-LAMP检测H3N8亚型马流感病毒方法。结果表明,RT-LAMP方法能够在63℃恒温条件下、75min内实现目的基因片段的大量特异性扩增,通过荧光显色就可直接用肉眼判断结果。对H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒的核酸无交叉反应,具有较好的特异性;方法的灵敏度比常规RT-PCR的高10倍;该方法操作简便快速、省时省力,而且灵敏度高、特异性强,对H3N8亚型马流感病毒的检测具有实际的应用价值。 相似文献
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自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。 相似文献
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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表述.本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础. 相似文献