应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

不同保存条件下云杉八齿小蠹总DNA提取方法的比较分析

[目的]探讨云杉八齿小蠹总DNA的提取方法。[方法]将野外采集的云杉八齿小蠹分别保存在95％的酒精浸泡、自然风干和-40℃条件下,采用改良CTAB法、KAc法、盐析法和SDS法对不同保存条件下样品材料总DNA进行提取。[结果]结果表明,4种方法均可从95％酒精浸泡标本和-40℃冻存样品中提取出高质量的总DNA,相比之下改良CTAB法最为简单、高效、经济。以COI的通用引物对所提取的总DNA进行扩增检测,结果表明,采用改良的CTAB法可以从95％的酒精浸泡样品和-40℃冰存样品DNA中扩增出清晰的单一条带,片段大小700bp,经与已知昆虫的COI片段分子量对比,可以初步断定其为COI片段。[结论]该研究结果为今后小蠹类的分子系统学研究奠定基础。     

实时荧光PCR法快速检测地中海实蝇的研究

[目的]设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物,建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法.[方法]采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段,经测序、比对分析,设计出扩增地中海实蝇的特异性引物,用SYBR Green实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度.[结果]设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇,扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2.该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3 ng/μL.[结论]所建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高.     

褐拟谷盗的快速分子鉴定方法

文中应用PCR法和PCR-RFLP法建立了褐拟谷盗的快速分子鉴定方法。结果表明:①PCR法中,采用依据褐拟谷盗COI基因设计的特异性引物进行PCR扩增,其产物经电泳检测证实,能快速准确地鉴定褐拟谷盗;②PCR-RFLP法利用2组简并引物对目标拟谷盗的COI基因进行PCR扩增,并借助HindIII限制性内切酶对扩增产物进行酶切后,进行电泳检测,该法也可用于检疫工作中对褐拟谷盗的快速鉴定。     

褐拟谷盗的快速分子鉴定方法

文中应用PCR法和PCR-RFLP法建立了褐拟谷盗的快速分子鉴定方法.结果表明：①PCR法中,采用依据褐拟谷盗COI基因设计的特异性引物进行PCR扩增,其产物经电泳检测证实,能快速准确地鉴定褐拟谷盗;②PCR-RFLP法利用2组简并引物对目标拟谷盗的COI基因进行PCR扩增,并借助HindⅢ限制性内切酶对扩增产物进行酶切后,进行电泳检测,该法也可用于检疫工作中对褐拟谷盗的快速鉴定.     

基于种特异引物(SS-COI)快速鉴定锈红果实蝇

[目的]开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究.[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列,筛选设计了一对能够准确鉴定锈红果实蝇的种特异性引物XF29和XR293,选用锈红果实蝇作为阳性对照,颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)等19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增和电泳检测.[结果]仅阳性种锈红果实蝇在约265 bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余实蝇均未出现任何条带.[结论]采用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ基因序列筛选设计的特异引物种特异性和稳定性强,可为进出境果蔬检疫、疫情早期预警和有效监测防治提供快速鉴定的依据.     

基于种特异性PCR技术快速鉴定葡萄根瘤蚜

摘要：葡萄根瘤蚜是一种严重威胁葡萄生产的入侵性害虫。由于蚜虫类害虫种类多、体型微小、形态相似,难以快速准确地进行鉴别。文章以葡萄根瘤蚜为研究对象,以常见果树蚜虫为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的种特异性PCR方法,研究葡萄根瘤蚜的快速鉴定技术。利用mtDNA COI基因通用型引物LCO 1490/HCO 2198获得葡萄根瘤蚜及其他果树常见蚜虫的COI序列,根据测序结果设计1对种特异性SS COI引物（VitF269/VitR557）,扩增片段大小为308 bp。种特异性检验结果显示,该对引物仅对葡萄根瘤蚜的mtDNA COI基因具有扩增效果,其他5种蚜虫均没有扩增条带。     

马铃薯炭疽病菌分离与鉴定

[目的]对进境船舶上携带的带病马铃薯薯块进行了病原真菌的分离鉴定,明确其检疫重要性,并对病菌的快速鉴定方法进行研究。[方法]通过形态学观察和ITS序列分析对病菌进行了鉴定,并对已有的巢式PCR方法进行了验证。[结果]形态学观察和ITS序列分析表明,病原菌为球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。巢式PCR中用特异性引物Cc1NF1/Cc2NR1扩增C.coccodes得到了349bp特异性条带。[结论]巢式PCR方法可以用来对C.coccodes进行快速鉴定,该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌,在国内口岸属首次截获。     

一种昆虫的分子生物学鉴定

[目的]生物学鉴定攀西地区1种重要的经济昆虫。[方法]采用分子生物学技术对该昆虫进行线粒体细胞色素氧化酶（COI）基因种属特异性研究。[结果]利用PCR技术扩增出长度为1 100 bp的序列,经过序列分析比对,确定该昆虫属于昆虫纲,广翅目（Mega-loptera）,齿蛉科（Corydalidae）,巨齿蛉属（Acanthacorydalis）。[结论]结果为人工养殖该种昆虫提供了重要的理论依据。     

肉品中两种致病菌的双重PCR快速检测技术的研究

[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径.     

基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术

【背景】西花蓟马（Frankliniella occidentalis）是世界性农业和园艺作物害虫,也是我国重要的对外对内检疫对象。西花蓟马具有两个品系,即温室品系（greenhouse race,GR）和羽扇豆品系（lupin race,LR）,二者在寄主范围、抗药性、生存环境等方面均具有明显差异,但外部形态相似,无法准确鉴别。【目的】以西花蓟马温室品系和羽扇豆品系为靶标,以田间常见的其他14种蓟马为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I（mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mtDNA COI）基因的种特异性（species-specific COI,SS-COI）PCR法,研究一步双重品系快速检测技术。【方法】采用mtDNA COI基因通用引物获得西花蓟马温室品系和羽扇豆品系以及其他常见蓟马的COI序列,根据测序结果以及数据库已公开数据,设计筛选获得可同时扩增两个品系的特异性组合引物（TF6/GR32/LR12）,其中TF6为品系通用上游引物,GR32为温室品系特异性下游引物,LR12为羽扇豆品系特异性下游引物,其扩增片段大小分别为温室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp;对组合引物比例和退火温度进行优化;同时,对组合引物的种/品系特异性和灵敏性/检测阈值进行检验。【结果】当组合引物TF6/GR32/LR12比例为1.0/0.2/0.8、退火温度为44℃时,扩增效果最好。种/品系特异性检测结果证实,该检测技术仅对西花蓟马温室品系和羽扇豆品系具有扩增能力,对田间常见的其他14种蓟马包括花蓟马（Frankliniella intonsa）、禾花蓟马（Frankliniella tenuicornis）、黄胸蓟马（Thrips hawaiiensis）、大蓟马（Thrips major）、棕榈蓟马（Thrips palmi）、烟蓟马（Thrips tabaci）、普通大蓟马（Megalurothrips usitatus）、豆喙蓟马（Mycterothrips glycines）、草木樨近绢蓟马（Sussericothrips melilotus）、蔗腹齿蓟马（Fulmekiola serrata）、稻简管蓟马（Haplothrips aculeatus）、榕端宽管蓟马（Mesothrips jordani）、榕母管蓟马（Gynaikothrips ficorum）和横纹蓟马（Aeolothrips fasciatus）等不具有扩增能力。灵敏性检测结果显示,该组合引物不仅对单一品系或混合品系的成虫具有良好的扩增效果,对单粒卵、1龄和2龄幼虫以及预蛹和蛹均具有同样的扩增效能;对温室品系的最低检测阈值为35.90 pg·μL ^-1,相当于1/10 240头雌成虫,对羽扇豆品系的最低检测阈值为146.95 pg·μL ^-1,相当于1/2 560头雌成虫;同时,对来自不同地域的同一品系不同单倍型的成虫亦具有良好的扩增效能。【结论】建立的技术体系完全可以用于西花蓟马品系的快速鉴定及检疫监管,对有效阻截其进一步传播扩散及靶向防控措施制定意义重大。     

SSR标记技术鉴定新食葵6号品种纯度的研究

[目的]通过利用SSR分子标记技术测定向日葵种子纯度,以期为生产加工应用提供准确、便捷的杂交种种子纯度鉴定方法提供依据.[方法]该研究以新食葵6号及其双亲的DNA为模板,通过DNA提取、PCR扩增反应和 制作电泳的步骤,进行了约100对SSR物分子标记的筛选.[结果]SSR多态引物标记532在新食葵6号母本分别产生特异条带大小为496bp,父本特异标记条带大小为451 bp;引物标记574在母本上特异条带大小为364 bp,父本上的特异标记条带大小为384 bp,同时室内分子鉴定的纯度和田间鉴定纯度基本一致;通过SSR分子标记方法可出可得到区分父本、母本和杂交种的引物标记532和574,这2个引物标记可有效用于鉴定上述新食葵6号杂交种种子的纯度,辨别种子的真伪.[结论]该方法具有简单,快速、准确、重演性高的优点,目前该方法已成为向日葵品种鉴定的主要方法.     

新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

[目的]建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据.[方法]针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali,污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveu和Valsa.malicola的rDNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物.[结果]属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带,检测灵敏度为10 pg/mL;设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.nivecum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308bp的条带,检测灵敏度均为10 pg/mL.[结论]采用腐烂病菌Valsa的rDNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法,可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测.     

花斑皮蠹和黑斑皮蠹(鞘翅目:皮蠹科)的快速分子鉴定

斑皮蠹属昆虫个体小,形态高度相似,仅依据外部形态难以鉴定。用线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因的通用引物,分别以黑斑皮蠹(Trogoderma glabrum)、花斑皮蠹(Trogoderma variabile)的DNA为模板,进行PCR扩增、测序。比较二者COI的碱基序列,找出所有序列多态性位点及相应的限制性内切酶,最终选取限制性内切酶AflⅡ对二者进行酶切。结果表明,黑斑皮蠹的COI序列可被限制酶AflⅡ切开,形成535bp和347bp两部分,而花斑皮蠹COI片段中因不具有AflⅡ酶切位点而不能被切开,从而将二者成功区分,实现对黑斑皮蠹和花斑皮蠹的快速分子鉴定。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

落叶松八齿小蠹伴生致病菌的特异性快速检测

落叶松八齿小蠹Ips subelongatus严重危害落叶松Larix spp.林,造成了巨大的经济和生态损失,被列为中国林业危险性有害生物。长喙壳类真菌（ophiostomatoid fungi）是小蠹虫伴生菌中的最主要类群,在小蠹虫危害寄主甚至导致寄主死亡的过程中起到了重要作用。一些长喙壳类真菌是重要的植物病原物,具有强致病力。实现病原菌的特异性和快速检测是明确病害分布和评估其危害的前提条件。为克服传统组织分离受多种因素制约的缺陷,对2种病原菌进行快速特异性聚合酶链式反应（PCR）检测,以内源转录间隔区（ITS）为目标序列,对比Endoconidiophora属和Ophiostoma属的14个近缘种,分别筛选出可以从目标真菌类群以及寄主组织中扩增出特异性片段的种特异性（SS-）PCR引物对OK1/OK2和CFU1/CFU2。引物对OK1/OK2可以从O. olgensis中特异性扩增出1条248 bp的清晰明亮条带,引物对CFU1/CFU2可以从E. fujiensis中特异性扩增出1条251 bp的清晰明亮条带。使用特异性引物能够直接从感病韧皮部组织中检测出O. olgensis和E. fujiensis。     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18SrDNA和5.8SrDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

菠菜霜霉病菌快速分子检测方法研究

[目的]菠菜霜霉病,由专性寄生病原菌Peronospora farinosa,sp.Spinaciae引起,是世界上菠菜Spinacia oleracea种植中最为重要的经济型病害.建立菠菜霜霉病菌快速分子检测方法.[方法]将菠菜霜霉病菌进行显微镜的形态鉴定;提取DNA、PCR扩增、克隆、酶切、测序、序列比对与分析;采用巢式PCR技术检测菠菜霜霉病:第一轮采用通用引物ITS1/ITS4,第二轮采用特异性引物SMPF/SMPR.[结果]该菌与霜霉属的形态特征描述一致,确定菠菜患有霜霉病;测序结果经Blast比对分析与Peronospora effusa同源性达100;;巢式PCR技术也特异性的检测到了菠菜霜霉病菌.[结论]建立针对菠菜霜霉病的快速分子检测技术.     

利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究

[目的]建立一种快速准确的鸭源性成分检测方法.[方法]分别以线粒体16S rRNA基因和COⅠ基因序列为靶位点设计鸭特异性引物,以常见畜禽肉(羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉)DNA为模板,进行PCR扩增,检测引物的特异性和灵敏度.[结果]筛选的引物能够有效地对鸭源性成分进行检测,方便简洁,灵敏度较高.[结论]该方法能够快速有效地鉴别畜禽肉中鸭源性成分.