大豆和百脉根古老原核基因的全基因组鉴定与比较分析

在漫长的进化过程中,高等真核生物从原核生物中获取了大量基因,对这些基因进行鉴定分析,可为研究高等植物系统演化及基因组水平比较分析提供理论依据。为了进一步解析大豆和百脉根古老原核基因在其基因组中所起的作用及进化关系,本研究利用生物信息学技术对大豆和百脉根基因组古老原核基因进行全基因组鉴定,并对其特征及功能进行了比较分析。研究结果表明,大豆(40.6%)古老原核基因的占比高于百脉根(33.9%),且多分布于内共生细胞器线粒体、叶绿体中。此外,古老原核蛋白质的结构域在大豆和百脉根基因组中的分布相似,表明其在大豆和百脉根进化过程中具有较高的共线性和保守性。通过GO注释发现大豆与百脉根中古老原核蛋白主要分布在膜系统、细胞、细胞组分中。在分子功能上,大豆古老原核蛋白更多地参与代谢和发育过程,这可能与其接受了更多的人为选育有关。在生物过程中,古老原核蛋白更多参与催化反应和结合反应,主要以酶的形式在发挥作用。通过比较分析,本研究揭示了古老原核蛋白在大豆和百脉根中进化的独特模式,可为其他豆科植物基因组分析提供一定理论基础。     

大豆GmCYS20基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程。克隆了大豆的1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20,基因编码区全长为291bp。氨基酸多序列比对分析发现,大豆GmCYS20蛋白与野生大豆cystatin蛋白相似性高达99%。构建GmCYS20基因的植物表达载体,通过发根农杆菌介导的百脉根发状根转化法获得转GmCYS20基因复合体植株,利用GUS染色和RT-PCR方法鉴定阳性发状根。复合体植株接种根瘤菌4周后,转GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照,结瘤指示基因的转录水平也呈上升趋势。进一步对接种10d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。结果表明:GmCYS20基因通过促进根瘤的起始与发育,从而参与调控共生结瘤过程。研究结果可为揭示豆科植物与根瘤菌的共生互作机制提供新的分子生物学证据。     

大豆GmCYS20基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程。克隆了大豆的1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20,基因编码区全长为291 bp。氨基酸多序列比对分析发现,大豆GmCYS20蛋白与野生大豆cystatin蛋白相似性高达99%。构建GmCYS20基因的植物表达载体,通过发根农杆菌介导的百脉根发状根转化法获得转GmCYS20基因复合体植株,利用GUS染色和RT-PCR方法鉴定阳性发状根。复合体植株接种根瘤菌4周后,转GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照,结瘤指示基因的转录水平也呈上升趋势。进一步对接种10 d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。结果表明:GmCYS20基因通过促进根瘤的起始与发育,从而参与调控共生结瘤过程。研究结果可为揭示豆科植物与根瘤菌的共生互作机制提供新的分子生物学证据。     

谷子AGO基因家族全基因组鉴定及特征分析

阿尔戈蛋白（Argonaute proteins,AGO proteins）作为一种高度保守的RNA诱导沉默复合物,与基因转录和转录后沉默有关。目前,植物AGO基因功能的研究主要集中在拟南芥和水稻,对谷子AGO基因功能尚无文献报道。本研究利用生物信息学方法在谷子全基因组中鉴定出15个具有保守结构域和位置顺序的家族成员,分布在7条染色体上,其编码的蛋白质长度在862～1148 aa之间。系统进化分析显示,谷子AGOs蛋白分布在3个进化分支,与拟南芥相比,家族成员数量有所扩展;组织表达特异性分析表明,谷子AGOs大部分基因在穗部表达强烈,推测其参与生殖发育基因调控;蛋白互作结果预测显示,所有谷子AGOs蛋白都与三种蛋白质相互作用,其中DNA介导的RNA聚合酶v亚单位1已被证明与转录水平基因沉默有关。表明AGO基因在谷子进化过程中结构和功能保守,可为谷子AGO基因家族成员的功能研究提供理论基础。     

GA20-氧化酶基因转化豆科牧草百脉根的研究

以豆科植物百脉根子叶为转化受体，通过根癌农杆菌介导方法将外源目的基因GA20－氧化酶（GA20－oxidase)和NPTⅡ基因导入，经筛选分化，再生，得到具有卡那霉素抗性的转基因植物。在卡那霉素筛选浓度的选择中，25mg/L是百脉根较为适宜的筛选浓度。头孢霉素对农杆菌的抑制作用好于羧卞霉素。转基因植物移栽大田后生长良好。PCR检测证明外源目的基因已整合到百脉根基因组中。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1个1674bp的开放阅读框,编码557个AA,编码蛋白属于IIb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T0代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T1代转基因株系进行抗盐分析发现,在200mmol·L-1 NaCl处理14d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

本研究应用RT—PCR方法扩增到我国2005年-2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK／CH／LSD／05I与疫苗株H120同源性最高（93.4％）。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株（9株）分布于第1群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK／CH／LSD／05I存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年-2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol, TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点。为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因。根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族。同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因。基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应。这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate?acyltransferase,?GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol,?TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程.蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点.为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因.根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族.同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因.基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应.这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础.     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

狂犬病病毒全基因组进化研究进展

狂犬病病毒基因进化研究能够揭示病毒流行病学特点和规律,为有效防控狂犬病提供科学依据.狂犬病病毒基因组5个基因中,目前对N基因和G基因研究比较多,N基因序列分析可用于基因分型,G基因序列分析可用于病毒免疫原性、毒力、宿主转换等相关研究.多株狂犬病病毒已完成全基因组测序,但全基因组水平的进化研究还很不足,因为基因组中的各个基因之间的相互作用,各个基因面临的选择压力不同,单个基因的进化不一定能代表病毒的进化,所以需要不断探索合适的方法对狂犬病病毒全基因组进行进化研究.     

小反刍兽疫病毒N基因的原核表达

目的是表达出小反刍兽疫病毒的核蛋白,并鉴定其活性.根据GenBank发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列,对其进行基因优化并合成.设计引物,利用PCR的方法扩增PPRV-N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达栽体pET-28a-N.阳性质粒转化原核...     

杆状病毒基因分子进化研究的新方法

利用基因组信息对病毒作进化分析是研究杆状病毒的基因组和分子进化的有效途径。通过比较杆状病毒基因组中基因的转录方向,建立了一种新的进化分析模式,并通过单个基因距离分析证实了此法的有效性。同时也介绍了杆状病毒基因组研究的新结果。     

苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析

蒺藜苜蓿的基因组较小,遗传转化相对容易,是国际上广泛用于研究豆科植物的模式植物,其全基因组测序已经完成。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子, 调节启动子中含W-box元件的调节基因和(/或)功能基因的表达, 从而参与植物的各种防卫反应。本研究以苜蓿基因组序列(Mt2.0)为材料,利用生物信息学方法分析苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的数目、种类、系统发生学、保守基序,结果表明,苜蓿中共有28个WRKY基因,其中5个基因含有2个WRKY结构域,共含有33个WRKY结构域,根据其结构域特点可以分为3个大类,同时与水稻WRKY基因进行了比较研究,发现基因数目远少于拟南芥和水稻,同时研究证实苜蓿与水稻WRKY基因的起源和进化关系存在较大差异,显示出苜蓿WRKY进化有其独特的特点,此外分析苜蓿WRKY基因的保守motif共有46个,筛选得到WRKY结构域的5个保守motif。该研究对苜蓿WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/100801株的分离鉴定及分子特征研究

本研究于2010年8月从河北省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行电子显微镜观察、鸡胚致病性试验、血凝特性试验等生物学特性及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白基因RT-PCR方法鉴定,结果表明分离株为IBV,命名为ck/CH/LHB/100801.根据GenBank中登录的IBV基因组序列,设计扩增病毒全基因组的19对引物,并扩增病毒基因组,采用3-RACE和5-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列.通过与已发表的参考病毒株全基因组序列比较表明,该分离株基因组全长为27 675bp,共有10个开放阅读框,其基因排序为:5'-cap-Replicase-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly(A)-3',纤突蛋白裂解位点为534RRFRR538.序列分析表明ck/CH/LHB/100801与台湾分离株TW2296/95的结构蛋白序列相似性高达99.8%,进化亲缘关系最近,推测两分离株间可能具有相同的进化来源.     

鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

对2006-2009年从山西各地疑似传染性支气管炎的病例中分离到的7株IBV地方分离株的核蛋白基因片段进行序列测定及分析。结果发现,7株IBV地方分离株核蛋白基因有5株含有一个长1 230 bp的ORF,其余2株含有1 227 bp,编码410/409氨基酸残基组成的多肽,与常用疫苗株H120推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象。与GenBank中的34株国内外分离毒株核蛋白基因推导的氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示41株IBV毒株分属于4个群,至少有3个群在我国流行,7个分离株分布在第Ⅳ群中,第IV群大多来自我国的北方地区地方分离毒株,第Ⅱ群来自我国南方地区的部分地方分离毒株,从N基因推导氨基酸进化树上分析可见,我国的IBV地方分离毒株主要分布在第Ⅱ和第Ⅳ群中,具有较明显的地理区域性,可见IBV地方分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群。     

狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因的克隆和表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌溶血素(Apx)ⅣA基因的原核表达,试验采用PCR方法扩增到目的片段,并将该片段连接到pMD18-T载体中,经PCR和限制性酶切鉴定后,在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段与pET28a连接。结果表明:ApxⅣA基因测序结果与GenBank中公布的核苷酸序列的同源性达100%,说明已成功构建猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-pET28a原核表达质粒;表达质粒经IPTG诱导成功表达了36 ku的ApxⅣA原核蛋白。     

血清4型禽腺病毒Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon)和五邻体蛋白(Penton)的串联蛋白及其多克隆抗体血清,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出Hexon基因和Penton基因,使用重叠PCR将Hexon基因和Penton基因串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到HP原核蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。SDS-PAGE分析显示,HP原核蛋白分子质量约为108 ku,Western Blot结果显示,HP原核蛋白可与His标签抗体和多克隆抗体血清特异性识别,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。