陆地棉黄萎病菌诱导抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为探明棉花黄萎病抗性的相关基因,对本实验室的一个高抗黄萎病陆地棉材料进行抑制消减杂交(SSH),以黄萎病菌诱导后48 h和未诱导的植株分别作为Tester和D river,提取总RNA并分离mRNA,通过合成cDNA双链及两次PCR扩增,富集诱导后植株中差异表达的片段。对两次PCR后的产物纯化,连接并转化到大肠杆菌中完成文库构建,共获得了434个阳性克隆。对插入片段进行PCR扩增后发现大小从0.45 kb到0.70 kb不等。指纹图谱分析将所有克隆分为20类,于每一类中取1个克隆进行测序分析。BLAST分析表明大部分克隆片段与其他病原菌诱导缩减库中的EST相似。缩减片段编码的蛋白与拟南芥的P450单加氧酶、病程相关蛋白、类甜蛋白以及几丁质酶等相似。此cDNA文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗黄萎病基因奠定了基础。     

陆地棉GhNAC1基因的克隆及抗黄萎病功能分析

黄萎病是造成棉花品质与产量下降的重要原因之一，探索棉花抗病机制对推动生态农业的可持续发展具有深远意义。在黄萎病菌胁迫的陆地棉ND601根组织全长cDNA文库中，筛选到1个与黄萎病胁迫相关的植物特异NAC转录因子基因，将其命名为GhNAC1。该基因cDNA序列全长1 213 bp，开放阅读框840 bp，编码279个氨基酸。GhNAC1没有信号肽和跨膜结构，定位在细胞核。qRT-PCR分析结果表明，GhNAC1受黄萎病菌胁迫后在根部特异表达，显著上调，表达量在抗性品种中显著高于感病品种。GhNAC1沉默后棉花对黄萎病抗性降低，水杨酸路径标志基因（PAD4、NDR1、NPR1和PR1）表达量降低，以上结果表明GhNAC1可能通过调控水杨酸信号通道参与棉花黄萎病抗性。     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。     

棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析

【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6,并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究,为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据,筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6,对其序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在黄萎病诱导下的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框(ORF)为258 bp,编码85个氨基酸残基,理论等电点(pI)为9.34,脂肪系数为73.41,平均疏水性为-0.793,相对分子质量为9.86 kD,不稳定指数为73.41,为亲水性、碱性的非跨膜蛋白,无信号肽,定位于细胞核,在第11~63氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上,说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照(未侵染处理,CK)极显著下调(P<0.01),72 h时显著上调(P<0.05,下同),24和48 h时与CK无显著差异(P>0.05)。与阴性对照植株TRV:00相比,GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重,病情指数显著升高,茎秆的褐变程度更严重,且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染,当抑制GhMYB6基因表达后,棉花对黄萎病菌的敏感性增强,抗性明显降低,推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

海岛棉单萜合酶基因克隆及其受黄萎病诱导的表达分析

[目的]克隆海岛棉品种新海15中单萜合成酶基因(GbTPS),研究其受黄萎病诱导的表达情况,为进一步研究该基因在棉花抗黄萎病中的功能打下基础.[方法]克隆Gb TPS基因的开放阅读框(ORF)全长序列,对其蛋白序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR及病毒诱导的基因沉默对其抗病性进行分析.[结果]通过PCR扩增得到一个全长为1761 bp的ORF序列,命名为Gb TPS(GenBank登录号:KP247548).生物信息学分析发现,该基因编码586个氨基酸,预测分子量为67.7 kD,等电点为5.79.系统进化树分析结果表明,GbTPS属于Tps-g亚家族.GbTPS基因经黄萎病菌诱导后,表达量在4~24h内显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空白对照组.病毒诱导的基因沉默受黄萎病诱导后其病情指数为52.38,与对照组相比并无明显差异.[结论]GbTPS基因仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用.     

用PCR-差别筛选法分离和克隆水稻受稻瘟病菌诱导的cDNA片段

以水稻抗瘟性近等基因系H7R和H7S为材料,采用PCR-差别筛选（PCR-based differential screening）的方法分离和克隆水稻受稻瘟病菌诱导的抗性相关基因。第一轮筛选获得42个差异表达的cDNA克隆,经PCR扩增,转膜,反向Northern杂交后,得到12个阳性cDNA克隆。Northern证实其中一个克隆（暂命名为D2,约2.2kb）为受稻瘟病菌诱导的特异反应基因(片段)。     

陆地棉光合系统ⅡPsbR基因的克隆和表达分析

以拟南芥光合系统Ⅱ PsbR蛋白序列为探针,通过电子克隆的方法得到陆地棉光合系统Ⅱ PsbR基因的cDNA序列,进行序列分析,并对其在棉花不同组织中的表达水平进行研究。结果表明:克隆得到1条699bp的棉花PsbR基因cDNA序列,预测其ORF长为420bp,编码139个氨基酸,蛋白分子质量为14.26ku;多序列比对结果显示,棉花PsbR蛋白与牧豆树、马铃薯等具有较高的相似性,与芜菁、菠菜等的相似率较低;在进化关系上,棉花PsbR蛋白与葡萄、蓖麻、杨树等亲缘关系较近,与黄瓜、芜菁、烟草等进化关系较远;定量结果说明,PsbR基因在棉花不同组织中均有表达,但表达水平不同,在叶片中表达量最高。     

棉花GhGGPase基因克隆、序列分析及原核表达

[目的]棉花GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GhGGPase)基因的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]利用RT-PCR技术从棉花纤维中克隆棉花GhGGPase基因,进行生物信息学分析,构建原核表达载体pET28a-GhGGPase,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达.[结果]从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因的cDNA开放读码框为1350 bp,为包含450个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为49 kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,GhGGPase蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域.进化树分析的表明棉花GhGGPase与柑橘CuGGPase在进化上亲缘关系上较近.成功构建了pET28a-GhGGPase原核表达载体;获得分子质量约为49kDa左右的重组蛋白GhGGPase.半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhGGPase基因与棉纤维的快速伸长发育密切相关.[结论]GhGGPase基因的克隆、序列分析和重组蛋白的诱导表达为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

陆地棉CRK基因家族的鉴定及其表达分析

【目的】富含半胱氨酸类受体激酶（CRK）是植物中最大的类受体激酶家族之一,在植物生长发育、激素信号传导和抗逆境胁迫中发挥重要作用。从全基因组水平鉴定陆地棉CRK基因家族并进行生物信息学和表达模式分析,为研究和利用陆地棉CRK基因家族奠定基础。【方法】从Pfam数据库下载stress-antifung结构域氨基酸序列,应用BLASTp程序搜索棉花基因组数据库,鉴定棉花CRK基因家族;利用Compute pI/Mw tool、SignalP、TMHMM Server V2.0、WoLF POSRT等在线工具预测陆地棉CRK家族蛋白的分子量、信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位等;用ClustalX1.8软件对棉花和拟南芥CRK蛋白质进行氨基酸序列比对,MEGA5.0分析棉花和拟南芥CRK蛋白的系统进化关系;使用TBtools制作陆地棉CRK基因家族的染色体定位、基因结构和蛋白质结构域示意图;应用植物顺式调控元件数据库PlantCARE分析棉花启动子序列;通过植物磷酸化位点数据库PlantPhos预测陆地棉CRK家族蛋白的磷酸化位点;从NCBI数据库下载RNA-Seq数据,利用转录组定量工具Kallisto计算TPM值,通过在线工具Morpheus绘制陆地棉CRK家族基因表达热图。【结果】陆地棉基因组中有70个CRK基因,分布于14条染色体,其中52个基因（74.3%）集中串联成簇分布于A6/D6、A9/D9、A10/D10染色体,且在A/D染色体组之间呈现高度共线性关系。编码302-901个氨基酸,58个蛋白质（82.9%）具有跨膜结构域,主要定位于叶绿体、质膜和胞外。磷酸化位点预测结果表明,陆地棉和拟南芥CRK有5个相同的磷酸化位点基序,包括3种丝氨酸磷酸化位点基序和2种苏氨酸磷酸化位点基序。65个陆地棉CRK基因的启动子区（92.9%）至少含有一种逆境激素响应元件,69个基因启动子区（98.6%）至少含有一种生物或非生物胁迫响应元件。根据RNA-Seq数据分析结果,陆地棉CRK基因可分为3种不同的组织表达特征类型;盐、干旱、冷、热胁迫以及接种大丽轮枝菌均可以导致部分陆地棉CRK基因表达水平的改变。GhCRK25在根、茎、叶和胚珠中优势表达,在纤维中几乎不表达,ABA、GA3、SA、PEG-6000、氯化钠和大丽轮枝菌Vd991处理均能刺激GhCRK25迅速上调表达。应用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）沉默GhCRK25可导致棉花对大丽轮枝菌Vd991更为敏感。【结论】陆地棉CRK基因家族有70个成员,具有保守的基因结构和功能结构域,多样化的组织表达特征,大多数基因受激素和逆境调控。     

黄萎病胁迫下抗病陆地棉茎组织lncRNA的鉴定与分析

黄萎病是造成棉花产量和品质损失最为严重的病害之一。病菌侵染根组织后,通过茎组织扩展至叶,茎组织在寄主抗病菌扩展中起重要作用。长链非编码RNA（lncRNA）作为一种重要的调控分子,通过多种机制参与植物抗病等众多生物过程,因此分析了棉花茎组织lncRNA的抗病功能。对黄萎病菌胁迫下抗病陆地棉茎组织进行转录组测序,鉴定出971条抗病相关lncRNA。进一步分析黄萎病抗性相关lncRNA的表达特征及其对靶mRNA的调控方式,结果表明,棉花茎组织lncRNA响应黄萎病菌侵染具有明显的时序性,并且主要通过反式作用正调控靶mRNA。GO富集分析揭示差异表达lncRNA在细胞膜、胞外和胞内,通过多种分子功能响应黄萎病菌诱导的几丁质、缺水、缺氧等刺激和JA、ABA等植物激素信号,表明棉花茎组织lncRNA在抵御黄萎病菌侵染过程中起重要作用。基于上述结果并结合已有报道,构建了10条抗病相关lncRNA潜在的抗病机制,对深度解析这些lncRNA的抗病机理提供了重要依据。qPCR检测结果进一步揭示了lnc_011764和lnc_010753对其靶基因具有潜在的调控作用。该结果扩展了对抗黄萎病相关lncRNA的认识,为棉花抗黄萎病机制研究提供了新见解。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

棉花内生蜡状芽孢杆菌YUPP-10对棉花黄萎病的防治作用及机制

【目的】棉花黄萎病(Verticillium wilt)是世界性难以防治的病害,筛选有效的生防微生物资源成为解决棉花黄萎病的重要途径之一,本研究旨在分离一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为生物防治棉花黄萎病提供技术支持。【方法】用葡甘聚糖作为碳源筛选一株能够降解β-1,4糖苷键的棉花内生细菌YUPP-10,通过平板对峙培养、平板对扣培养和悬滴法等测定YUPP-10对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌丝生长和孢子萌发的抑制效果;用YUPP-10无菌滤液培养大丽轮枝菌微菌核,检测其对微菌核萌发的影响;利用基质接种法进行盆栽试验探究其对棉花黄萎病的防治效果;通过胚根、叶片接种病原菌,木质化和活性氧爆发研究YUPP-10诱导抗病能力;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测防御相关基因的表达。【结果】成功获取一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10,其整体代谢产物在7 d时对大丽轮枝菌的抑菌带宽为0.73 cm,挥发性代谢产物在10 d时对大丽轮枝菌菌落的抑制率为77.03%;YUPP-10无菌培养液对大丽轮枝菌孢子和菌核萌发的抑制率分别为17.22%—71.25%和10.69%—26.62%,且抑制率与无菌滤液的浓度呈正相关。在用YUPP-10玉米蛭石培养物拌土处理的盆栽试验中,其对棉花黄萎病的最高防效达到80.60%。诱导抗性试验发现YUPP-10诱导了胚根和叶片抗大丽轮枝菌的侵染,诱导了细胞木质化和活性氧的爆发。qRT-PCR检测结果显示YUPP-10成功激活了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHI)和病程相关基因(PR10)的表达,对大丽轮枝菌在棉花体内的扩散和生长起到了抑制作用。【结论】YUPP-10通过直接抑制病原菌的生长,同时诱导植物防御反应来抵抗病原菌的侵染和扩展,其具有良好的应用前景。     

嫁接棉花对棉花黄萎病抗性、产量和纤维品质的影响

【目的】研究嫁接棉花对棉花黄萎病抗性、产量和纤维品质的影响,探索通过嫁接来防治棉花黄萎病的可行性。【方法】选用已明确抗黄萎病的海岛棉Gossypium barbadense L.海7124和Pima90为砧木,以陆地棉G.hirsutum品种湘杂棉21和感病品系冀棉11为接穗,完成4个嫁接组合,将其种植在连作棉田,调查嫁接棉花和非嫁接棉花的棉花黄萎病、产量和纤维品质。【结果】嫁接棉花和接穗对照相比,棉花黄萎病明显减轻,有些嫁接组合的抗病性达到高抗水平。和接穗对照相比,多数嫁接组合的株高和果枝数高于对照,嫁接对多数嫁接组合的现蕾期、开花期、吐絮期、衣分、铃重以及纤维品质的大多指标影响不显著。4个嫁接组合的结铃数/m2、籽棉和皮棉产量均高于各自的接穗对照。【结论】选取合适的砧木和接穗嫁接组合,可以有效地防治棉花黄萎病和提高连作棉田的棉花产量。     

棉花黄萎病菌毒素对棉花生化代谢的影响

为明确棉花黄萎病菌毒素对棉花生化代谢的影响,采用棉花黄萎病菌毒素处理棉花黄萎病抗病和感病品种的棉苗后,测定棉株体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性以及丙二醛(MDA)和木质素含量的动态变化。结果表明,抗病品种陕7191对病菌毒素的抗性显著高于感病品种中棉19;接种毒素后2品种棉苗叶片SOD活性都降低,感病品种降幅高于抗病品种;感病品种POD活性升高较快,到达峰值后迅速下降,而抗病品种POD活性持续上升;2品种PAL活性变化趋势相似,接种后抗病品种活性始终高于感病品种;2品种MDA和木质素含量均增多,感病品种MDA含量的增幅和增量高于抗病品种。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

显性无腺体陆地棉(G.hirsutum L.)新类型的选育

研究了海岛棉(G.barbadense L.)显性无腺体品系海1与陆地棉(G.hirsutum L.)有腺体品种杂交,把控制无腺体的显性基因转移到陆地棉中,选育出显性无腺体陆地棉新类型的结果。转育过程经过了三次回交和两次自交及严格的人工选择。选出的株形,叶形,花冠大小、颜色、花无红心,铃,苞叶等器官与陆地棉亦无明显区别。     

HAG三种杂种回交后代腺体性状及形态特征遗传的研究

用陆地棉（ＡＡＤＤ）１与亚比棉（Ａ２Ａ２Ｇ１Ｇ１）进行杂交,Ｆ１高度不育,然后用陆地棉作为轮回亲本进行回交,在回交后代ＢＣ４Ｆ１中,各个性状都分离很大,除了表现双亲类型外,还出现了一些新类型,通过调查发现,３０４％植株保留了比克氏棉的子叶色素腺体延缓发生性状,这说明将这一性状作为目标性状进行选择是有效的,为我们进一步转育提供了可靠的依据。