五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的：研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

一步法多重RT-PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究

为了提高检测鸡肉中新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV)，禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)，传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV)的效率和敏感性，利用引物设计软件Primer Primer5.0设计了NDV的F基因片段，AIV的M基因片段，IBV的M基因片段的引物，在以前一步法RT-PCR扩增各种病毒RNA的基础上，进行了两种病毒和三种病毒的一步法多重RT-PCR的试验。结果确定了两种病毒的一步法多种RT-PCR的试验条件。三种病毒的一步法多重RT-PCR的试验条件基本确立，本试验初步建立了检测NDV，AIV，IBV一步法多重RT-PCR技术。     

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法，用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317，经G418筛选，获得数个稳定的产毒细胞克隆，择优挑选7个细胞克隆扩增培养，收集细胞上清，用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA，进行逆转录套式PCR，检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价，同时用传统方法（小鼠成纤维放大法）进行测定。2种方法检测结果的比较表明，逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法，是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

猪各组织器官内肌生成抑制素基因mRNA表达谱的研究

用Trizol试剂法提取军牧一号猪的骨骼肌、心肌、肝、肾、肺、脾、胰、脂肪的总RNA做RT-PCR和嵌套PCR,结果在军牧一号猪骨骼肌、心肌和脂肪组织内检测到了肌生成抑制素mRNA的表达,而在其他组织中未检测到.     

荔枝果皮总RNA提取方法的筛选

以三月红荔枝果皮为试验材料，通过采用改良CTAB法、SDS法、改良SDS法、改良Bugos法和RNAplant plus Reagent试剂盒（TIANGEN公司）提取总RNA，采用浓度检测、纯度检测、RT-PCR等方法进行提取结果检测，进而筛选出最佳的提取方法。结果表明，这五种方法都能从三月红荔枝果皮中提取出总RNA，但总RNA浓度和纯度有明显的差异。其中采用改良Bugos法、改良SDS法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取RNA的浓度较高；采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取的总RNA纯度较高，完整性较好。采用SDS法、改良SDS法和改良Bugos法所提取的荔枝果皮总RNA纯度低，降解严重。经RT-PCR验证，采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒均能扩增得到200bp的18sRNA编码基因片段。综合以上各项检测的结果，改良CTAB法为提取荔枝果皮总RNA的最佳方法，总RNA质量和得率满足后续分子生物学实验的需要。     

一步法多重RT-PCR检测猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸道综合征病毒

根据猪圆环病毒2型（PCV2）的ORF2和猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）ORF7相对保守区序列分别设计了两对引物PH1／PH2和PT1／PT2，将PCV2和PRRSV细胞毒按1：1混合，设为模拟样品，采用病毒基因组DNA／RNA提取试剂盒同时提取PCV2 DNA和PRRSVRNA核酸，利用2对引物进行一步法多重RT-PCR。结果同时得到与实验设计相符的560bp（PCV2）和398bp（PRRSV）特异性扩增条带，而对其他5种猪病原的扩增均为阴性。敏感性试验表明，建立的一步法多重RT-PCR方法可检测出10ngPCV2 DNA和5ngPRRSVRNA。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。     

RT-PCR快速诊断禽流感

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果,设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株,４个亚型１２株国内分离野毒株,ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２; ２４／５５、２４／５５, 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测,只用６个小时就可得出准确的诊断结果,证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。     

Detection of hepatitis E virus RNA in saliva for diagnosis of acute infection

Diagnosis of acute hepatitis E virus (HEV) infection is established by detection of anti‐HEV IgM antibodies by ELISA or by amplification of serum viral RNA. Here, we evaluate the diagnostic value of testing HEV RNA in saliva to identify patients with acute HEV infection. Prospective proof‐of‐concept study including patients with acute hepatitis. Whole blood and neat saliva samples were obtained from all patients. Saliva samples were processed and analysed for HEV RNA by RT‐PCR within 2 hr after collection. A total of 34 patients with acute hepatitis and 12 healthy donors were included in the study. HEV RNA in serum was confirmed by RT‐PCR in eight of these patients (23.5%; 95% CI: 12.2%–40.2%). HEV was isolated in the saliva of eight of 34 patients (23.5%; 95% CI: 12.2%–40.2%). All patients with HEV RNA amplified in saliva had detectable HEV RNA in serum. HEV was isolated neither in the saliva of any of the 26 patients without detectable HEV RNA in serum nor in healthy donors. Our study suggests that acute HEV infection could be diagnosed by assessing viral load in saliva.     

猪繁殖与呼吸道综合征RT-PCR诊断方法的建立

根据猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）核衣壳蛋白ＯＲＦ７的序列,设计了１套引物,对立了检测ＰＲＲＳＶ核酸的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对猪繁殖与呼吸道综合征（ＰＲＲＳ）标准毒株的检测,证明该方法不仅能够扩增出特异性的核酸片段。同时可以从基因水平上区分ＰＲＲＳＶ美洲型和欧洲型。使用该方法对国内临床上疑似为ＰＲＲＳ的送检样品进行检测,结果为阳性,并确定基因型均为美洲型。该研究建立的从组织中直接提取细胞总     

反转录─套式PCR方法检测鸡传染性法氏囊病病毒

采用蛋白酶 Ｋ 消化,酚、氯仿抽提的方法提取法氏囊匀浆和细胞培养液中的鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）基因组 Ｒ Ｎ Ａ,用特异的寡核苷酸引物对其 Ｖ Ｐ２ 高变区进行反转录套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增。应用该方法从一个法氏囊匀浆中即可特异地检出 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ,得到的扩增产物可用于分子流行病学的进一步分析,而从感染材料的处理到扩增结果的电泳检测,在两个工作日之内可轻松完成。本实验为法氏囊病病毒的诊断和分子流行病学的分析提供了一种快速、简便、可靠的手段。     

Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad.

This paper reviews the laboratory investigations that led us to isolate the Lelystad virus and demonstrate that this virus causes mystery swine disease. We describe: 1) isolating the virus from the disease; 2) characterizing the virus as a new enveloped RNA virus; 3) reproducing the disease experimentally with the isolated Lelystad virus; 4) isolating the virus from the experimentally induced disease.     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

套式反转录—聚合酶链反应检测恙螨及鼠肺内肾综合征出血热病毒RNA

选择覆盖肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成２对引物,采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ,建立了ＲＴ－ＰＣＲ检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法,扩增产物经凝胶电泳及斑点印迹杂交证实具有特异性。结果显示,ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离螨５０只组,ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠肺１０００ｍｇ、５００ｍｇ组经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性;ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组,ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只和１０只组,游离螨１０只和５只组,鼠肺ＨＦＲＳＶ抗原阳性１００ｍｇ组均未见有明显扩增带。进一步用套式反转录－聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）检测,在ＲＴ－ＰＣＲ未测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ。结果表明ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点,可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ,为确认恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了分子生物学证据。