犬细小病毒血凝特性的研究

犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒在PBS4℃下能凝集恒河猴、猪、马和猫的红细胞,不能凝集牛、绵羊、山羊、犬、兔、豚鼠、小鼠、地鼠、鸡、人O型和鹅的红细胞。在22℃、37℃,病毒血凝的敏感性降低,经2～3小时即从红细胞上解脱下来。红细胞浓度与CPV的HA滴度成反比,HI滴度则随着红细胞浓度的增加而平行升高。     

兔出血症病毒对人类红细胞的血凝谱研究

应用兔出血症病毒标准毒株与人类各型红细胞进行血球凝集反应(HA)。结果表明,兔出血症病毒能凝集人类各型红细胞,且对“O”型、“B”型和“AB”型红细胞的凝集反应快而强烈,HA效价很高(5×213 ～5×215);而对“A”型红细胞的凝集反应慢而弱,HA效价很低(5×21)。据此认为,除“A”型红细胞外,其它3 种血型的红细胞均可用于兔出血症的实验室诊断。     

水貂肠道呼肠孤病毒的分离鉴定及病原性研究

本文采用大连某貂场的病貂粪便,利用病毒分离、病毒鉴定、核酸电泳试验、血凝性试验、细胞感染试验、乳鼠接种和水貂回归试验等方法进行病原性试验研究。试验结果表明:该病毒为水貂肠道呼肠孤病毒,与无囊膜的RNA病毒特性相符;经PAGE按酸试验,出现清晰的10条带型;在4℃、pH7.0～7.4的条件下,对人O型红细胞发生凝集,不凝集人A、B、AB红细胞及牛、猪红细胞;F_(81)细胞接毒后24小时即出现严重细胞病变,电镜检查可发现大量呼肠孤病毒粒子。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝谱的研究

用家兔A型魏氏梭菌培养液处理的6株鸡传染性支气管炎病毒,以方阵试验分别与人O型红细胞及羊、猪、兔、鸡、鸭、鹌鹑、麻雀、小鼠等8种动物的红细胞作血凝试验,结果证明,鸡传染性支气管炎病毒H_(120)株和M_(41)株均能凝集人O型以及羊、猪、兔、鸡、鸭、鹌鹑、小鼠的红细胞,而不能凝集麻雀的红细胞;GIBV株和Connecticut株能凝集人O型以及免、鸡、鹌鹑、麻雀的红细胞,而不能凝集猪、羊、鸭、小鼠的红细胞;Gray株能凝集兔、鸡、鹤鹑的红细胞,不能凝集人O型以及猪、羊、鸭、麻雀、小鼠的红细胞;而经家兔A型魏氏梭菌培养液处理的T株和未经处理的6株病毒对人O型以及8种动物的红细胞都没有凝集性。试验还证明,M_(41)株和H_(120)株对人O型及8种动物的血凝活性水平有差异。     

人的各型红细胞用于“兔瘟”凝集反应诊断

在常规“兔瘟”凝集反应诊断中,都是采用人“O”型红细胞。笔者使用了“A”型、“B”型、“AB”型人的红细胞悬液作凝集反应,结果表明,“兔瘟”病毒对人的各类血型红细胞的凝集作用没有严格的选择性,红细胞悬液和全血的结果都是一致的。通过凝集与凝集抑制试验的检验,病毒对人不同血型红细胞的凝集现象均能被特异性的免疫血清所抑制。操作方便、取血方便、实用性强,敏感性高,但还有待进一步积累数据深入探讨。     

内蒙地区兔病毒性出血症病毒分离鉴定

从内蒙古武川县分离出2株兔出血症病毒，分别命名为RHD-NW1毒株和RHD-NW2毒株，对其进行了形态、理化及生物学特性研究。结果表明，2株病毒在兔体连续传4代均出现典型免病毒性出血症症状和病理变化，是毒力稳定的强毒株。病毒粒子在电镜下呈球形，直径30nm左右，无囊膜，有实心和空心2种病毒粒子。2株病毒对热(56℃6min)、酸（pH3)、乙醚和胰蛋白酶不敏感，对人的O、B型红细胞有高度凝集性。     

鸡减蛋综合征病毒血凝特性和在鸭胚中繁殖规律的研究

EDS病毒CH—1分离株能凝集鸡、鸭和鹅等禽类的红细胞,但不能凝集兔、小白鼠和人O型血红细胞。该病毒的血凝特性对缓冲液种类和浓度无严格要求。可耐受56℃24小时,但80℃作用30分钟,则几乎完全丧失血凝活性。1.0％胰酶和0.5％β—巯基乙醇对病毒血凝活性无明显影响,用0.1～0.4％甲醛37℃作用24小时血凝活性无变化,而0.5～1.0％甲醛处理后,病毒血凝价下降4～7个滴度。病毒反复冻融6次对血凝特性无影响。EDS病毒接种10日龄鸭胚后24小时就可检测到病毒的血凝滴度(2~(3.2))、96～120小时病毒在鸭胚液中的血凝滴度达到高峰(HA>2~(14)),此时胚液量也最大。病毒在鸭胚尿囊液和尿囊膜中的血凝滴度最高,其次是羊水,胚体中血凝滴度最低。     

玻片凝集试验快速检测兔出血热病毒的研究

本文进行了玻片凝集试验(SHA)快速检测兔出血热病毒的研究。通过对试验因素的优选,认为以样品稀释液pH7.2、试验温度4～22℃、选用人O或B型红细胞和摇动反应5min等条件为佳.另外,通过对比试验(与血凝试验、HA)、阻断试验和病毒样品及兔出血热疫苗的检测,认为本方法是一个特异性强、敏感性高、重复性好和便于推广应用的有效方法。SHA能在5min报告检测结果。     

H_(91-1)、Y_(81)G_4和AV_(-127)三株EDS_(79)病毒血凝特性的研究

H_(91-1)、Y_(81)G_4和标淮株AV-127三株EDS_(-76)病毒在4℃、22℃和37℃下均能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞,并具有很高的凝集滴度;不能凝集人、兔、绵羊等多种哺乳动物的红细胞。血凝的适宜pH值为6.8～7.4.红细胞最佳浓度为0.75～1.00％。稀释液最佳浓度为0.01M。血凝活性可耐56℃ 2小时、0.3％甲醛溶液、0.5％胰蛋白酶。血凝素受体对脂溶剂、胰蛋白酶不敏感。     

兔瘟

<正> 兔瘟又称兔病毒性出血症、兔病毒性败血症或兔出血性肺炎,是一种急性败血性传染病,呈毁灭性流行,给养兔业带来严重损失。病原本病病原是一种病毒,球形,直径为30—42毫微米,氯化铯中浮密度为1.3—1.34克/毫升,对乙醚、PH3和50℃有抵抗。病毒存在于病兔血液和各组织中,肝脏含毒量最高,肺、肾、脾等次之,各地分离的病毒具有交互免疫性。本病毒对人O型红细胞的凝集活性最强,对绵羊红细胞呈轻度凝集。     

鸭坦布苏病毒病活疫苗（FX2010-180P株）毒种保存期的研究

鸭坦布苏病毒病是新发的一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的传染病,目前仍没有疫苗可预防和控制该病。将鸭坦布苏病毒强毒（FX2010株）在鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fi broblasts,CEFs）上连续传代培养180代,获得1株致弱毒株（FX2010-180P株）,利用该弱毒株研制了鸭坦布苏病毒病活疫苗。本研究为了测定鸭坦布苏病毒病活疫苗（FX2010-180P株）毒种的保存期,将-80℃条件下保存了16个月的原始种子批和基础种子批各取3支,进行纯净性检验、鉴别检验以及病毒滴度测定。结果表明,各批次毒种在保存16个月后,病毒纯净无污染,病毒滴度没有明显下降。把基础种子在CEFs上增殖后,低剂量接种鸭子,检验毒种的免疫原性。结果显示,用毒种增殖的病毒免疫原性良好,101.5和102.5 TCID50的剂量可以为接种鸭提供90%和100%的保护。     

家蚕浓核病的血清学诊断方法

本文介绍了家蚕浓核病血清学诊断的系列方法,包括双向免疫扩散法(DID),对流免疫电泳法(CIEP),酶联对流免疫电泳法(ELCIEP),酶标组化法(IEHC),可溶性酶——抗酶法(PAP法),点免疫结合测定法(DIBA),生物素——亲和素系统(ABS)及胶乳凝集试验法(PAT)等,应用这些方法可以检测出的纯化浓核病毒(DNY)量(即检测灵敏度)为1×10~(-1)-1×10~(-4)O.D,以DIBA法检测灵敏度最高,分别为LAT法,ELCIEP法,CIEP法的10倍,160倍、1000倍,检测蚕体内的DNV时,可以在经口接种DNY后8-40小时检出阴性反应,以ABS法检出阳性反应最早,而在同样接种病毒的条件下,要到感染后5-6天才表现出明显的外观症状,试验表明,检出阳性反应时间越早,检出阳性率愈高,则最终发病率高,因此这些诊断方法可作为诊断家蚕浓核病的有效手段。     

A型流感病毒致病性及跨种间传播的分子生物学基础

A型流感病毒在温血动物中广泛存在,也是目前导致人类和各种动物流感疾病的主型。在自然情况下流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性,分离自人的流感病毒一般不能在鸡、鸭等禽类体内复制,同样禽流感病毒在灵长类动物体内的复制能力也极差。但近年来不断发生禽流感病毒（包括H5N1,H9N2,H7N7亚型病毒）直接传染给人的事件,而2009年爆发的人类的H1N1流感的病原则是猪源流感病毒重组而来。研究证实,流感病毒的致病性及跨种间传播的深层原因是病毒分子结构差异及其与宿主细胞相互作用。病毒多种结构蛋白和非结构蛋白某些功能位点上氨基酸的差异是病毒致病性及其跨中传播的分子生物学基础。     

新城疫病毒LaSotaC5株感染性克隆的构建及病毒拯救

将本实验室保存的一株LaSota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为LaSotaC5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照LaSotaC5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长eDNA的转录载体TVT．LaSotaC5。将TVT-LaSotaC5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI—L共转染BSR—T7／5细胞,成功拯救出了具有感染性的LaSota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

UL46基因移码突变对PRV毒力的影响

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(JS-2012株)在Vero细胞上40℃传代培养120代后,获得了1株弱毒株(JS-2012-F120株)。该毒株UL46基因3'端有29个碱基插入,导致了130个氨基酸突变。为了研究UL46基因移码突变对PRV生物学特性的影响,本研究用JS-2012-F120的ΔUL46基因替换了JS-2012的UL46基因,构建了重组病毒JS-2012-ΔUL46,并对该重组病毒、高温传代毒株(JS-2012-F120)及其亲本强毒株(JS-2012)在细胞上的生长特性和对小鼠的毒力进行了比较分析。结果显示,与亲本毒株(JS-2012)相比,传代毒株(JS-2012-F120)病毒滴度明显提高,对小鼠的毒力明显减弱;重组病毒(JS-2012-ΔUL46)在Vero细胞上的生长趋势没有明显改变,对小鼠的毒力减弱。因此,UL46基因移码突变对PRV在Vero细胞上的复制没有明显影响,但减弱了PRV对小鼠的毒力。     

重组H8N4亚型禽流感病毒的拯救

将H8N4亚型流感病毒的HA和NA基因插入双向转录/表达载体pHW2000中,并与本实验室保留的适应毒株A/PR/8/34(H1N1)的6个质粒pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS共转染293T和MDCK混养细胞,在细胞内部完成病毒粒子的组装,然后接种SPF鸡胚,经3代扩毒后,成功拯救了H8N4亚型重组流感病毒,并对其进行鉴定及生物学特性分析。本研究结果为该亚型禽流感病毒变异机理研究及疫苗的研制等奠定了基础。     

逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒定量检测的影响

为探讨逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)定量检测的影响,本研究针对PRRSV保守性序列设计引物,优化反应体系及反应条件,建立准确检测PRRSV的数字PCR方法,并选择5种不同逆转录试剂盒,分析逆转录过程对数字PCR检测结果的影响。结果表明,建立的数字PCR方法线性关系良好(R^2为0.9995及0.9999),重复性良好(变异系数1.01%);利用不同逆转录试剂盒得到的定量结果存在显著性差异,揭示逆转录过程是影响RNA病毒定量检测的关键因素,提示实验过程中不同逆转录试剂盒的选用需要考察与分析。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

两株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称为"猪蓝耳病",是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪传染性疾病。本研究将采集到的2份疑似患有PRRS的流产胎儿的肺组织研磨后离心,取上清液接种猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)盲传3代。通过RT-PCR方法和间接免疫荧光方法,对组织样品及细胞培养物进行了鉴定和分型。结果显示本研究成功从2份样品中分离到了类NADC30,且该毒株可以在PAM细胞上增殖。该研究结果为研究类NADC30毒株的重组机制、致病情况及研制预防疫苗提供参考。