不同产区加工的茯砖茶中“金花”菌的分离及分子鉴定

为探明不同地域茯砖茶中"金花"菌的异同,采用陕西、湖南和浙江3个产区同等级的黑毛茶为原料,分别在本地及其他2个产区同一时期加工成9个茯砖茶样,运用纯培养技术,观察茶样中"金花"菌在不同培养基上的形态特征,同时结合现代分子生物学技术,对茶样中的"金花"菌进行了鉴定。结果表明:从9个茯砖茶样品中,分离获得了13株"金花"菌,在不同培养基中的形态学特征与散囊菌属的特征非常相近,且菌株G9、G10的形态特征与其他"金花"菌明显不同;通过对特异性区段ITS和β–tubulin序列扩增、测序,经同源序列搜索比对及构建的系统发育树进一步分析,并参照Hubka最新的曲霉属分类系统,最终将不同地域(陕、湘、浙)加工的茯砖茶中的优势菌鉴定为冠突曲霉,异名冠突散囊菌;浙江产区加工的茯砖茶中分离获得的非优势"金花"菌G9和G10鉴定为谢瓦曲霉。     

茶叶中23株真菌的分离鉴定

我国茶叶特别是发酵茶叶中含有许多有益真菌,其代谢产物具有抗菌、抗癌、降脂、降压的功能。目前,关于茶叶中真菌功能的研究很多,但在畜牧业中尚无相关应用研究。取湖南安化金花茯砖茶、天福南糯山熟饼、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁门红茶和金茯茶共8种茶叶进行真菌分离、纯化,共得到23株菌株,通过形态学和ITS基因序列的鉴定,共得到拟茎点霉菌1株,变色栓菌1株,枝状枝孢菌1株,黑曲霉2株,曲霉菌1株,冠突曲霉2株,阿姆斯特丹曲霉6株,棕曲霉2株,格孢菌1株,扩展青霉菌1株,拟盘多毛孢菌1株,球孢枝孢菌2株,变色曲霉2株。结果为这些真菌的进一步研究和在生产实践中的应用提供了物质基础。并且将其中的优势菌属冠突散囊菌进行扩大培养,为后期的生产实践做好准备。     

泾阳茯茶生产环境中冠突散囊菌多样性检测

为阐明陕西省泾阳县茯茶生产环境中冠突散囊菌是否为同一克隆系,分别从泾阳县2个代表不同生产方式的茯茶厂的不同生产工段采集原料茶叶、茯茶半成品及成品、生产环境涂抹拭子、空气沉降样和土壤等样品,采用平板划线和涂布法分离得到26株疑似冠突散囊菌,并对其进行分类鉴定。结果表明:基于菌落形态特征鉴定后,初步确定26株菌为"冠突散囊菌"。对26株"冠突散囊菌"26SrDNA D1/D2区及其内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer;ITS)序列进行PCR扩增、序列测定并提交基因库比对,使用Mega 6.0软件构建进化树分析鉴定后,确认得到的菌株均为冠突散囊菌,且菌株的26SrDNA D1/D2区及ITS序列均具有高度的同源性。研究初步阐明存在于陕西省泾阳县茯茶生产环境的冠突散囊菌相似度极高,为同一克隆系。     

茶窖中微生物群落分布多样性及普洱茶内生菌和茶品质的研究

为了探究茶窖中微生物群落结构的多样性,建立普洱茶茶窖微生物库,明确普洱生茶由于不同的存放环境而造成的茶品质差异的原因,采用平板涂布分离技术和测序技术,对从茶窖环境中分离的微生物和茶叶内生菌进行了培养和分子鉴定,并通过感官测评和成分检测对茶品质进行了判定。结果显示,在茶窖环境中经分离纯化共得到157株细菌、119株真菌和163株茶叶内生菌。茶窖中长期累积的菌斑鉴定结果显示,大部分为曲霉属,数量最多的是黑曲霉。普洱茶的重金属、农残、致病菌、水分、总灰分和水浸出物均符合国家标准,存放两年后,相比于自然环境存放的普洱茶,窖藏的普洱茶的茶多糖、茶褐素和咖啡碱含量增高,而游离氨基酸、茶氨酸、茶多酚、儿茶素和茶红素的含量降低。研究表明曲霉属,尤其是黑曲霉,可能对普洱茶品质的转化影响很大。本研究可以为普洱茶窖藏技术的推广提供一定的理论基础。     

浅盘与传统普洱茶发酵的微生物群落和化学成分比较研究

传统普洱茶渥堆发酵一般包含数吨茶叶基质,发酵中存在热传递不均匀的问题.为此建立了浅盘普洱茶发酵系统,并比较了浅盘与传统普洱茶发酵的微生物群落结构和化学成分差异.测定发现2种发酵过程化学成分变化规律类似,浅盘发酵出堆样的水浸出物、可溶性糖、茶红素和黄酮质量分数显著高于传统发酵出堆样(p0.05),茶褐素质量分数显著低于传统发酵出堆样(p0.05). 2种发酵过程微生物群落结构不同,传统发酵出堆样品优势细菌为葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和考克菌(Kocuria),优势真菌为曲霉属(Aspergillus)、芽生葡萄孢酵母属(Blastobotrys)和根毛霉(Rhizomucor);浅盘发酵出堆样品优势细菌为芽孢杆菌属(Bacillus)和欧文氏菌属(Erwinia),优势真菌为Brunneoclavispora和曲霉属(Aspergillus).审评结果表明, 2种发酵出堆茶样都具有较好的感官品质.今后还应研究优化浅盘发酵的条件,以提高普洱茶品质.     

金花菌发酵对茶叶主要化学成分的影响

为探明金花菌发酵对铁观音茶叶主要化学成分的影响,从湖南茯砖茶、广西六堡茶和云南普洱茶等茶叶样品中分离到10株不同形态的金花菌株,接种到铁观音茶汤中发酵培养,对发酵液中茶多酚、氨基酸的变化进行检测。在此基础上,将菌株接种到铁观音茶叶中进行固体发酵,通过UPLC检测分析茶水浸出物和发酵前后茶叶干重。结果表明,10个金花菌株发酵铁观音茶汤后,发酵液中茶多酚的含量均变化显著,氨基酸含量变化不显著,但是氨基酸的种类较为丰富,其中含有7种人体必须氨基酸;10个菌株在铁观音茶叶中发酵35 d后,茶叶干物质含量均下降,减少0.6~0.9 g,茶叶中主要成分茶多酚物质含量也均减少,UPLC分析表明菌株发酵茶中增加了多种新成分;10个金花菌菌株在铁观音茶叶和茶汤中均生长良好,说明金花菌并非黑茶的特有菌株。金花菌对茶多酚的转化利用能力高,菌株发酵茶叶后,茶叶中增加了多种新成分。     

一株冠突散囊菌的分离鉴定及其液体发酵研究

实验研究了从泾阳茶厂分离到的一株"金花菌",对其进行生理生化及分子生物学鉴定,鉴定结果为冠突散囊菌。利用这株菌进行茶汤的纯种发酵,以自然发酵作对比,分析发酵前后茶汤的变化。实验结果表明:茶多酚,多糖,氨基酸,生物碱在发酵液的不同时期含量有不同的变化。     

“湘益”牌茯砖茶真菌的分离及鉴定研究

采用平板梯度稀释法对金湘益特制礼品茯砖茶中真菌进行了分离纯化和计数,获得2301、2401、3302、4304、5402等5种类型真菌,其中5402为优势菌,每克茶样中含量达4.98×106个,其余为非优势菌,数目相对较少。运用18S rDNA片段序列进行同源比对,结合形态学鉴定方法对其进行鉴定,表明菌株2301为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、2401为产黄青霉(P.chrysogenum)、3302为青霉(Peni-cillium sp.)、4304为酱油曲霉(Aspergillus sojae)、5402为蜡叶散囊菌(Eurotium herbariorum)。     

甘肃省陇南、天水林区土壤曲霉属种的研究

 对100份来自陇南、天水林区的土样进行曲霉属(Aspergillus Mich. ex Link: Fr.)菌的分离,结合菌落形态及显微镜下孢子的形态将各菌鉴定到种。结果表明:甘肃省陇南、天水林区土壤中分布有6个种和4个变种。分别是烟曲霉原变种(Aspergillus fumigatus var. fumigatus)、烟曲霉椭孢变种(Aspergillus fumigatus var. ellipticus)、土曲霉原变种(Aspergillus terreus)、杂色曲霉原变种(Aspergillus versicolor)、刺孢裸胞壳(Emericella echinulata)、构巢裸胞壳(Emericella nidulans var. nidulans)、褶皱裸胞壳(Emericella rugulosa)、四脊裸胞壳(Emericella quadrilineata)、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)及矮棒曲霉(Aspergillus cavatonaicus)。     

甘蔗叶内生真菌的多样性

从甘蔗叶中分离出内生真菌并对其多样性进行分析。结果发现,从不同季节和不同叶片部位的甘蔗叶中共分离到172株内生真菌,通过菌落形态学特征和ITS序列鉴定这些内生真菌分属为8属10种;从夏季的叶片中分离到6属8种,冬季的叶片中分离到7属9种;从老叶中分离到全部的8属10种,幼叶中分离到5属6种。主要优势种为曲霉属(Aspergillus sp.)和炭疽菌属(Colletotrichum sp.),两者占总菌株分离数的85%以上。     

嫁接茄子根际真菌的区系变化

试验分离鉴定了嫁接茄子的根际真菌,结果显示,嫁接改变了茄子根际真菌的数量,各嫁接处理根际真菌的优势种主要是烟曲霉原变种(Aspergillus fumigatus var. fumigatus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、腐皮镰孢(Fusarium solani)和土曲霉(Aspergillus terreus);CK则主要是土曲霉(A. terreus)、露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)和腐皮镰孢(F. solani)。各嫁接处理根际真菌的优势种均包含对黄萎病菌有高拮抗作用的烟曲霉原变种,这可能与嫁接茄比自根茄抗病性强有关。     

云南景迈山不同生境茶园及茶窖空气微生物群落分布多样性研究

【目的】研究景迈山普洱茶区不同生境茶园及茶窖的空气微生物群落结构多样性和差异性,对景迈山普洱茶区的微生物进行溯源,更好地保证景迈山原产地生产的普洱茶微生物的一致性。【方法】利用安德森空气微生物采样器对4个不同生境茶园(CY-A～CY-D)和茶窖(CJ)的空气采样,采用平板涂布分离技术培养采集的微生物,并利用分子生物学技术鉴定其种类。【结果】在茶园和茶窖的空气微生物中经分离纯化共得到310株细菌和191株真菌,分别归类于27个细菌属和18个真菌属,4个茶园空气微生物丰富性不同(CYCCY-ACY-BCY-D),但均分离得到肠杆菌属(Enterobacter);茶窖的微生物群落不含肠杆菌属,而以链霉菌属(Streptomyces)、曲霉属(Aspergillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)为主。【结论】景迈山不同生境下的空气微生物群落组成有差异性,茶树品种或套种品种越多的茶园,空气微生物种类越丰富,肠杆菌属是景迈山普洱茶区空气微生物群落组成的显著特征,为进一步探究普洱茶微生物的来源提供一定的数据支持。     

黑茶发酵优势菌对茶多酚的生物转化研究

利用从茯砖茶中分离出的冠突散囊菌和从普洱茶中分离出的黑曲霉、根霉分别接种于以茶多酚作为唯一碳源的培养基中,进行单一菌株发酵,对发酵过程茶多酚类化合物的变化规律进行分析.结果表明,发酵期内,随着发酵时间延长,各发酵液的茶多酚总量显著降低,冠突散囊菌、黑曲霉、根霉发酵液中多酚分别降低38.9％、85.5％和92.1％;黄酮类总量在黑曲霉、根霉的作用下先下降后上升,冠突散囊菌则波动上升;各处理儿茶素总量均显著下降,其中酯型儿茶素含量直线下降,非酯型儿茶素和没食子酸的含量均先增加后减少.在黑曲霉、根霉作用下,茶黄素、茶红素含量显著减少,茶褐素含量增加.冠突散囊菌发酵液中茶黄素含量减少,茶红素含量增加,茶褐素含量基本不变.基于不同优势菌对茶多酚的转化在质和量上均有差异,有必要对其转化产物进行深入研究.     

藏茶渥堆过程中真菌种群的鉴定

为了提高藏茶品质和改进工艺,对雅安藏茶渥堆过程中存在的真菌种群进行了分类鉴定。结果表明:藏茶渥堆过程中主要存在着黑曲霉(Aspergillusniger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、总状枝毛霉(M.racemosusFres.)、炭黑曲霉(Aapergillus carbonarius)、根霉(Rhizopus Ehrenberg)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和简单枝霉(ThamnidiumsimplexBrefeld)等7种真菌。     

茯砖茶中冠突散囊菌的分离鉴定及富硒菌株筛选

对陕西茯砖茶中冠突散囊菌进行分离与鉴定，并筛选出具有较强富硒能力的菌株。从8种陕西茯砖茶中分离出54株纯化菌株，通过形态学观察及ITS基因序列分析鉴定得到32株冠突散囊菌。经硒胁迫培养从中筛选出8株耐硒能力强的冠突散囊菌，并确定其生长最适硒质量浓度为30 μg/mL。进一步的富硒培养结果表明，菌株SXFCD.8在此硒浓度下的富硒能力最强，其生物量为（28.92±0.94） mg/100mL，富硒量为（628.38±20.96） μg/g。最后利用LC-ICP/MS对菌株SXFCD.8的硒形态进行分析，共检测到6种硒形态，其中4种与标准物质相匹配，包括SeMet、SeCys2、MeSeCys和Se（IV）。硒形态分析表明冠突散囊菌具有较强的有机硒转化和富集能力。     

5种高产洛伐他汀曲霉的筛选和鉴定

从不同生境(食品、土壤、空气、有机质等)收集的自然发酵样品中分离纯化获得150株曲霉纯菌株;经薄层层析法(TLC)初筛获得25株产洛伐他汀(Lovastatin)的曲霉菌株;进一步用高效液相色谱法(HPLC)复筛获得5株Lovastatin产量较高的曲霉菌株,产量范围为32~56 mg/L。对筛选的5株曲霉菌株进行形态特征描述和鉴定,依据曲霉菌株菌落特征、显微特征,结合18S r DNA或ITS r DNA基因序列,鉴定这5株菌株分别为棒曲霉(Aspergillus clavatus)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、菌核曲霉(Aspergillus sclerotiorum)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。     

不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定

从湖南地区采集18个不同品种茯砖茶样品,采用稀释平板法分离得到18株优势菌,观察其平板形态特征与生长特征,以及在电镜下有性与无性生殖结构等特点,初步确定其中15株优势菌为散囊菌属:8株冠突散囊菌(Eurotium crista-tum)、3株谢瓦散囊菌(Eurotium chevalieri)、2株肋状散囊菌(Eurotium costiforme)、1株阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amsteloda-mi)和1株蜡叶散囊菌(Eurotium herbariorum);还有3株非散囊菌属优势菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。结果表明茯砖茶中优势微生物存在较大差异。     

微生物发酵床大栏养猪垫料中曲霉菌的分离与鉴定

从福建省福清和永泰2个基地共采集106份垫料样品,采用稀释平板法分离曲霉菌.对从不同样品中分离到的曲霉菌菌株的初步形态进行归类后,从不同类群中共选取10个代表性菌株,经菌落培养和菌体形态观察,再结合β-微管蛋白基因(Ben A)序列分析进行种类鉴定.共鉴定出曲霉菌6个种,即构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、亮白曲霉(A.candidus)、聚多曲霉(A.sydowii)、土曲霉(A.terreus)、黄曲霉(A.flavus)和烟曲霉(A.fumigatus).从福清养猪发酵床垫料中分离鉴定出除烟曲霉外的其他5种曲霉菌,而从永泰养猪发酵床中仅分离到土曲霉、黄曲霉和烟曲霉.结果表明养猪地区不同,其发酵床中的曲霉菌种类组成存在差异.     

汽蒸前后六堡茶中优势微生物的分离鉴定

选取汽蒸前、后六堡茶茶样,分离纯化得到7株优势菌,采用传统方法观察菌落特征、利用光学显微镜观察菌株的形态,结合分子生物学水平对菌株进行DNA序列分析,通过ITS序列进行同源性搜索比对、对系统发育树分析。结果共鉴定出六堡茶汽蒸前的优势菌为塔宾曲霉、黑曲霉、胶红酵母、LB3青霉、灰黄青霉、鞘氨醇单胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。而在汽蒸后的六堡茶里没有塔宾曲霉以及黑曲霉,说明其在高温汽蒸时已被杀死,而其余5种微生物因耐高温而保留下,对六堡茶的陈化起到重要作用。     

响应面法优化“金花”菌培养基配方

采用单因素试验和响应面法对冠突曲霉液体培养基进行优化,以子囊孢子浓度为响应值。通过单因素实验确定最佳含水量、氯化钠浓度、接种量分别是10 ml、5%、240μl。使用Design expert 8中的Box-Behnken design(BBD)进行试验设计,采用响应面分析法优化出液体培养基最佳配方是在10 g麸皮的基础上,添加Na Cl 6.13%(0.613 g),9.79 m L无菌水,接种246.48μl浓度为108个/ml"金花"菌孢子悬液,28℃条件下,培养7 d,发酵物浸泡过滤处理得孢子含量达3.51×10~7个/m L。优化后仅用简单、经济的麸皮培养基就能快速培养得到高浓度的金花菌孢子,这些孢子按需求洗脱稀释后即可用于人工接种,这促进了金花菌人工接种发花的普及,同时为培养基的优化提供了参考。