旋毛虫成虫可溶性抗原对猪的免疫保护作用研究

 首次在猪体系统地研究了旋毛虫成虫可溶性抗原免疫猪、预防猪旋毛虫病的效果。将纯净成虫经超声粉碎后，10000r/min离心30min，取上清液即为成虫可溶性抗原。将抗原按不同剂量与等体积弗氏完全佐剂乳化后按不同程序经腹腔免疫猪，免疫后不同时间攻击感染不同数量的肌幼虫。结果表明，成虫可溶性抗原可诱导猪产生坚强的免疫力，0.5mg组最高减虫率达98.21%，接近全保护。免疫力高低与免疫剂量大小、免疫程序及攻击感染的肌幼虫数量多少有关。免疫可使次代肌幼虫的感染性降低，免疫血清在体外可杀伤肌幼虫。     

旋毛虫感染刺激宿主产生抗旋毛虫抗体的消长规律

应用旋毛虫成虫期、新生幼虫期及肌幼虫期的排泄分泌物(ES)抗原作为包被抗原,ELISA方法检测感染旋毛虫试验小鼠2个月内不同天数血清中抗旋毛虫抗体Ig M和Ig G水平,并采用Excel软件绘制其抗体消长规律曲线并进行数据分析,了解旋毛虫感染宿主后不同发育时期刺激宿主机体产生抗旋毛虫抗体的变化规律,旨在为临床上能够合理利用旋毛虫不同发育时期的ES抗原诊断旋毛虫的感染提供理论依据。结果表明:可以利用旋毛虫3个发育时期ES抗原的混合物来检测旋毛虫45 d前的感染(即5~14 d的感染检测Ig M、15~45检测Ig G);感染45 d之后,可以利用单一肌幼虫时期ES抗原检测Ig G,最有意义的发现是利用旋毛虫成虫期和新生幼虫期的ES抗原可以有效检测14~19 d的感染。此研究成功获悉旋毛虫感染宿主后不同发育时期刺激机体产生抗旋毛虫抗体的消长规律,为进一步研究利用旋毛虫不同发育时期抗原诊断旋毛虫感染情况及解决"诊断盲区"(感染后14~19 d)问题提供了重要的科学依据。     

旋毛虫基因重组抗原对小鼠的免疫保护试验

分别用５μｇ和１５μｇ的旋毛虫基因重组抗原对小鼠进行腹腔注射免疫，结果于免疫后第４周小鼠体内的抗体效价明显上升，至第７周达到高峰，当每只鼠用９０条旋毛虫肌幼虫口服攻击后，抗体效价稍有下降，但到攻虫后的第５周基本回升至攻击前水平。     

旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析

应用感染旋毛虫60 d猪血清为抗体探针,对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得旋毛虫肌幼虫期强反应原性抗原基因,利用生物学信息网站(NCBI、BLAST等)及其相关软件(DNA star等)对获得的基因进行序列分析。结果表明:筛选约2.5×105个重组噬菌体,获得13个阳性克隆,有6个克隆为同一个基因,编码蛋白与染色体结构维持蛋白(SMC蛋白,structural maintenance of chromosome proteins)同源性为48.1%,在免疫筛选中均有较强的反应信号;有3个克隆为同一个已知基因(AAF63473),编码蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor)同源性为99%,在免疫筛选中反应信号次之;还有2个为同一个基因,与旋毛虫线粒体(Mitochondrion ofTrichinella spiralis)DNA有较高的同源性(同源性为87.7%),编码核糖体大亚基RNA,其他2个为未曾报道过的新基因,编码不同的未知蛋白,这4个克隆在免疫筛选过程中反应信号相对较弱。得到的2个强反应原性的旋毛虫肌幼虫cDNA分子,其中相对信号最强cDNA分子编码SMC蛋白,另一个编码丝氨酸蛋白酶抑制因子,二者有望用于旋毛虫病的诊断候选抗原基因。     

旋毛虫各隔离种某些生物学特性的研究

通过对猪、犬旋毛虫和国际标准隔离种:旋毛形线虫(T.spiralis)和本地毛形线虫(T.nativa)的研究发现,猪旋毛虫和 T.spiralis 在小鼠膈肌中出现保姆细胞的时间比较早,分别于感染第16d 和18d 出现,第38d 和36d 所有幼虫都已形成保姆细胞,而犬旋毛虫和 T.nativa 出现保姆细胞的时间较晚,于感染第20d 和22d 出现,第32d 完全形成.猪旋毛虫和 T.spiralis 雌虫体外培养24h 平均产新生幼虫数分别为66.0和76.2,而犬旋毛虫和 T.nativa 分别是28.8和22.0,前二者在雌虫体外产新生幼虫能力上明显高于后二者.研究结果表明,黑龙江猪旋毛虫为 T.spiralis,犬旋毛虫为 T.nativa.     

6株旋毛虫49ku ES抗原基因克隆及序列分析

应用RT-PCR方法从不同来源的6株旋毛虫肌幼虫总RNA中克隆49 ku ES抗原基因序列,与GenBank中T.spiralis相应序列进行比对分析.结果表明,旋毛虫49 ku ES基因具有相当强的保守性,不同虫株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别达97.2％和94.0％以上,序列间差异很小,不能较好地区分各旋毛虫种;该...     

旋毛虫肌幼虫总RNA提取方法研究初报

【研究目的】探索高质量的旋毛虫(Trichinella spiralis)肌幼虫总RNA提取方法;【方法】利用Trizol试剂采用三种方法提取旋毛虫肌幼虫总RNA。(1)液氮预冷的研钵中研磨新鲜虫体至样品快融化时,加入适量的Trizol,继续研磨至液状后转移到离心管中;(2)A将新分离的虫体放到-20℃预冷的研钵中,在研磨过程中不断地添加液氮以保持虫体冷冻,之后对冷冻状的样品粉末继续操作;B把液氮冻存的新鲜旋毛虫肌幼虫取出,放到-20℃预冷的研钵中重复A的操作;(3)新鲜虫体放入匀浆器中,加适量Trizol,在冰水混合物中研磨20分钟。虫体破碎后按Trizol说明书继续抽提。最后通过凝胶电泳和紫外吸收光度值检测。【结果】用液氮和Trizol结合的方法,使用新鲜样品提取旋毛虫肌幼虫总RNA,在纯度和得率上都较为理想;【结论】使用新鲜的样品,且液氮与裂解液结合,是获得高质量RNA的可行方法。     

猪囊尾蚴“四性细胞系”代射产物（可溶性抗原）的免疫原性

应用仔猪20头,以猪囊尾蚴“四性细胞系”的可溶性抗原作为免疫原,对经过第1次用不同细胞剂量疫苗免疫的猪,再次用与细胞数量相适应的细胞代射产物的不同剂量疫苗,对其中的11头进行第2次免疫以第2次还是注射细胞疫苗的3头、只注射1次细胞疫苗的2头,和空白对照猪2头作对照组,以观察代射产物抗原的免疫原性。于第1次细胞疫苗免疫后的68d,最长94d用细胞加代谢产物疫苗进行了这次免疫,14d后攻虫,每头使用人有钩绦虫卵,6000枚,3个月后屠宰检查虫体。第1次用10万细胞疫苗免疫,第2次用1千万细胞加代谢产物疫苗免疫该组动物中的2头,平衡有5个囊尾蚴,但这2头猪均发生了囊尾蚴钙化;另一组第1次用100万细胞疫苗免疫,第2次用2千万细胞加代谢产物疫苗免疫该组全部3头动物,平均有3.6个囊尾蚴,这3头猪也都有囊尾蚴钙化。2个实验组出现免疫猪的100%的钙化现象,是免疫治疗作用,是猪囊尾蚴四性细胞系代谢产物的特殊免疫作用。     

旋毛虫肌幼虫cDNA文库的免疫筛选及初步分析

用旋毛虫感染猪血清对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行了免疫筛选,从1 6×105个重组噬菌体中筛选出21个阳性克隆。阳性克隆的测序结果表明:有9个克隆为未曾报道过的新基因;有9个克隆不含有开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体DNA同源,编码核糖体大亚基RNA;3个克隆为旋毛虫已知基因,其中克隆ML12,34与Serineproteaseinhibitor[Trichinellaspiralis](AAF63473)同源性为99%,克隆ML42与HypotheticalOFR17 20[Trichinellaspiralis](AAB48489)同源性为99%,与21kDExcretory secretoryprotein[Trichinellapseudospiralis](AAF79206)同源性为90%,这为进一步研究基因重组抗原奠定了基础。     

猪旋毛虫McAb快速ELISA法的应用研究

本研究用保存在小鼠中的猪旋毛虫、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、犬旋毛虫、本地毛形线虫(T.naliva)四种不同来源的旋毛虫隔离种接种断乳仔猪,定期用 ELISA 法检测抗体出现情况,剖杀后用鲜肉及冷冻不同时间的肉制成内汁,进行 ELISA 抗体检测.结果表明:用 ELISA 法检出阳性的时间为:猪旋毛虫和 T.spiralis 在16d 以后,犬旋毛虫和 T.nativa 在24d 以后;鲜肉肉汁 ELISA 检测结果与其血清结果基本相同;冻肉肉汁检疫中,短期内冷冻对 ELISA 检测结果也影响不大.     

旋毛虫排泄-分泌抗原的制备及在免疫学诊断中的应用研究

目的:将排泄-分泌抗原用于Dot-ELISA免疫学诊断试验,检测其抗原特异性和敏感性。方法经培养24h、48h、72 h排泄-分泌抗原ES1、ES2、ES3,对38头份猪旋毛虫病阳性猪血清、98头猪旋毛虫阴性血清、26头猪囊虫阳性血清、35头猪蛔虫阳性血清和21头猪细颈囊尾蚴阳性血清进行了Dt-ELISA免疫学方法检测并于粗抗原进行比较。结果排泄-分泌抗原的特异性为ES1(99.44%)、ES2(96.11%)、ES3(92.77%),敏感性ES1(97.36%)、ES2(92.11%)、ES3(84.21%)。结论排泄-分泌抗原ES1(培养24小时)抗原特异性强,敏感性高,重复性好,用于旋毛虫病的免疫诊断有重要作用。     

利用改进的一步法提取本地毛形线虫总RNA

利用胃蛋白酶消化小鼠肌肉,获取了旋毛虫种本地毛形线虫(T.nativa)的肌幼虫虫体。利用TRIZOL混合虫体直接提取肌幼虫的总RNA,通过分光光度计Ultrospec 3000检测结果,以及用RT-PCR方法扩增出了编码T.na- tiva 49 kDa的ES蛋白结构基因,后续试验结果显示改进的一步法提取本地毛形线虫总RNA效果很理想。     

转移因子对猪丹毒杆菌SpaA抗原免疫效果的影响

为了探寻转移因子(Transfer factor,TF)对猪丹毒杆菌SpaA(Surface protective antigen A)蛋白抗原免疫效果的影响,将重组SpaA蛋白与双相佐剂乳化后(称SpaA抗原)免疫小鼠,取免疫小鼠和未免疫小鼠脾脏,以超滤法分别制备特异性TF和普通TF,并利用BCA法测定所得TF的质量分数,经过无菌及安全性检测后,将2种TF分别腹腔接种至小鼠体内,24 h后,对2组TF处理后的小鼠均免疫SpaA抗原,并以未接种TF的免疫小鼠作为对照(仅免疫组)。分别于免疫后12 d、21 d和30 d对小鼠进行采血,用间接ELISA法对小鼠血清进行抗体检测。结果表明,利用原核表达系统表达的重组SpaA蛋白分子质量60 ku且具有可溶性;以超滤法制备的特异性TF质量浓度为2.56 mg/mL,普通TF质量浓度为2.40 mg/mL,且2种TF安全无毒;抗体检测数据显示,2种TF处理组在免疫后21、30 d的抗体水平均高于仅免疫组,且差异显著,而2种TF处理组之间抗体水平差异不显著。因此,TF能诱导SpaA抗原快速产生抗体,提高SpaA抗原的免疫效果,但与TF的特异性关系不大,表明TF可作为猪丹毒杆菌基因工程亚单位疫苗的免疫增效剂,提高免疫动物的抗体水平。     

用数学预测方法研究旋毛虫成虫寄生寿命

传统的旋毛虫实验方法主要是通过接种肌旋毛虫蚴包囊给大量小鼠,定期解剖检获肠旋毛虫成虫计数来测算旋毛虫成虫在宿主体内的存活时间(即寄生寿命)及动态消长情况。这种研究方法费时、工作量大,也不经济.现采用数学方法较成功地预测旋毛虫成虫寄生寿命,收到事半功倍的效果.传统实验方法:人工感染肌旋毛虫540条给实验小鼠(总数60只),定期剖杀,用玻片刮取小肠的粘膜     

不同旋毛虫隔离种对低温抵抗力的研究

分别用来自黑龙江省猪、犬体内的旋毛虫和国际标准虫种旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa)感染兔,在-20℃和-30℃条件下对其进行冷冻试验。结果表明,猪旋毛虫和T.spiralis对低温耐受性较差,兔肌肉内的猪旋毛虫幼虫在-20℃经7 d、在-30℃经1 d就失去感染性,T.spiralis的幼虫在-20℃经1 d、在-30℃经1 d已全部死亡;而犬旋毛虫和T.nativa对低温抵抗力较强,犬旋毛虫幼虫在-20℃经20 d、在-30℃经过23 d仍未失去活力,T.nativa的幼虫在-20℃经36 d、在-30℃经28 d才失去感染性。     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

NS1基因主要抗原区的可溶性表达及其Dot-ELISA检测方法的建立

【目的】可溶性表达猪流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原区(NS1′)蛋白,获得具有良好抗原性的NS1′蛋白,并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法,为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础。【方法】以质粒pET28a-NS1为模板,PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1′,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pET-32a(+),构建pET32a-NS1′,经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导表达,纯化NS1′并免疫家兔制备多克隆血清,对其进行SDS-PAGE、Western blotting检测和免疫荧光分析,并以纯化的NS1′作为包被抗原初步建立Dot-ELISA检测方法。【结果】PCR扩增获得了长约250bp的H3N2SIV NS1′片段;成功构建了重组载体pET32a-NS1′;SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,融合蛋白NS1′大小约34ku,该蛋白可溶,能与感染SIV的猪血清特异性反应,并且用纯化蛋白NS1′制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NS1,建立的Dot-ELISA检测方法可鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪。【结论】实现了H3N2SIV NS1′蛋白的可溶性表达,表达产物具有良好的抗原性,以NS1′作为包被抗原,建立了检测NS1抗体的Dot-ELISA方法。     

猪囊尾蚴病抗体消长与治疗的关系

作者在研究猪囊尾蚴病特异诊断与治疗基础上,以研究发病后其抗体(IgG)消长的规律,为该病的早期诊断与早期治疗提供理论依据,进行了人工感染囊虫病并以作者研究的“改良酶标法”测其抗体,以证实抗体的最早出现、上升、达到峰值及持续和下降的时间。对30多头猪人工感染后,每3天采全血检测一次,结果证明最早出现的时间为感染后第9、15、18d、也有21d。此后逐渐上升(其座标呈波动式上升的曲线),40～60d达到峰值并持续,直至虫体死亡开始下降。药物治疗15天后抗体明显下降,第20～30d抗体基本消失,30d后全部消失。     

水牛巴贝斯虫病可溶性抗原疫苗的疫区应用试验

体外培养获得的东方马贝斯虫可溶性抗原与等量弗氏完全佐剂混合作用作疫苗进行疫区免疫保护试验。试验动物共分２组,免疫级８２头牛在发病季节前１个月用疫苗间隔２周免疫２次,对照组不作处理。所有试验动物在试验前和发病季节后分别采血检测血清抗体水平,同时,在发病季节观察试验动物的发病情况。结果表明：在发病季节内,免疫组牛无一发病,血清抗体水平与试验前相比升高明显,而对照组８６头有５头出现临床症状,虽经治疗仍有２头死亡,血清抗体水平与试验前相比变化不明显。结果说明由可溶性抗原制备的疫苗具有良好的免疫保护作用。