末梢血涂片T淋巴细胞非特异性酸性酯酶染色法对67例2至3月令健康猪T淋巴细胞正常值的测定

本文叙述了 T 淋巴细胞非特异性酸性酯酶染色法应用于猪细胞免疫水平体外测定的操作技术;并对97头2～3月令临床症状键康猪 T 淋巴细胞正常值的测定结果进行了探讨。结果表明 T 淋巴细胞非特异性酸性酯酶染色法基本可靠、快速简便。适宜兽医科研、教学和临床检验等方面参考。在猪的喘气病研究中,为测定猪的细胞免疫水平找到一个简便、快速而可靠的方法,我们对 T 淋巴细胞非特异性酸性酯酶染色法应用于猪以及其它家畜,反复进行了试验,并对67头2～3月令无临床症状健康猪 T·B 淋巴细胞百分率进行了测定。     

应用脂酶染色法对布氏杆菌病奶牛T淋巴细胞的测定

本文应用酸性α—醋酸萘酯(ANAE)染色法,测定了30头健康奶牛和30头布氏病奶牛外周血中的T淋巴细胞值,发现两者差异极显著,因此,此方法可作为测定T淋巴细胞值的有效手段之一。     

中草药免疫增强剂对鸡T-淋巴细胞数量的影响

为探讨中草药免疫增强剂的作用机理,进行了鸡T淋巴细胞数量的动态观察。将240只1日龄雏鸡随机分为3组:1组为对照组,其余2组分别饮用10和5mL/L中草药免疫增强剂48d,采用α醋酸萘酯酶染色(ANAE)法检测了12,24,36和48日龄各组鸡血液中T-淋巴细胞数量。结果显示,饮用中草药免疫增强剂后,T-淋巴细胞百分率较对照组显著提高,且10mL/L中草药免疫增强剂组T-淋巴细胞百分率较5mL/L组显著提高。并运用组织学常规切片技术和ANAE法,观察了10mL/L中草药免疫增强剂组和对照组在14和21日龄时鸡小肠黏膜淋巴组织中T淋巴细胞的数量分布。结果显示,10mL/L中草药免疫增强剂组鸡小肠的T淋巴细胞数量与对照组相比差异显著。上述结果表明,该免疫增强剂对鸡T-淋巴细胞数量有显著的提高作用,且10mL/L组的效果优于5mL/L组。     

上海黑白花高产母奶牛外周血酸性酯酶标记T淋巴细胞正常值的探讨

应用酸性酯酶标记法(即 ANAE 染色法)测定了100例不同年龄,不同胎次的无结核病和无布氏杆菌病的临床健康的上海黑白花高产母奶牛 T 淋巴细胞的正常值,分别为:5～7月龄的犊牛和10岁以上的老牛的 T 值为35.9623±7.3728%;2～3岁的青年牛的 T 值为39.2800±6.2930%;5-6岁的中年牛 T 值为41.0400±7.3781%。为诊断、预防奶牛疾病提供了依据。     

3种高致病性猪蓝耳病疫苗对仔猪免疫器官的损伤作用

【目的】研究3种高致病性猪蓝耳病(PRRS)疫苗(MLV、TJM92、JXA-1R)对仔猪免疫器官的损伤作用。【方法】选取50头初生健康仔猪,分为4组进行免疫:未免疫空白对照组(CK组)、MLV疫苗免疫组(A组)、TJM92疫苗免疫组(B组)、JXA-1R疫苗免疫组(C组)。病理剖检后,制作石蜡切片,通过优化的酯酶染色(α-ANE染色)、甲基绿-派洛宁染色(MG-P)方法统计各免疫器官的酯酶阳性T淋巴细胞和浆细胞(效应B淋巴细胞)比率变化。【结果】各免疫组的免疫器官酯酶阳性T淋巴细胞和浆细胞所占百分比与对照组存在显著或极显著差异。【结论】3种疫苗对仔猪免疫器官均有不同程度的损伤作用,具体表现为JXA-1R疫苗损伤作用最强,TJM92疫苗次之,MLV疫苗最弱。     

3种PRRS疫苗对仔猪免疫器官的损伤作用

【目的】研究3种蓝耳疫苗(MLV、TJM92、JXA-1R)本身对仔猪免疫器官的损伤作用。【方法】选取50头初生健康仔猪,分为4组进行免疫:未免疫空白对照组(CK组)、MLV疫苗免疫组(A组)、TJM92疫苗免疫组(B组)、JXA-1R疫苗免疫组(C组)。病理剖检后,制作石蜡切片,通过优化的酯酶染色(α-ANE染色)、甲基绿-派洛宁染色(MG-P)方法统计各免疫器官的酯酶阳性T淋巴细胞和浆细胞(效应B淋巴细胞)比率变化。【结果】各免疫组的免疫器官酯酶阳性T淋巴细胞和浆细胞所占百分比与对照组存在显著或极显著差异。【结论】3种疫苗对仔猪免疫器官均有不同程度的损伤作用,具体表现为JXA-1R疫苗损伤作用最强,TJM92疫苗次之,MLV疫苗最弱。     

马、骡T淋巴细胞的测定

参与机体免疫反应的细胞主要有T淋巴细胞和B淋巴细胞等。T淋巴细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的一项重要指标。家畜在某些疾病状态下,T淋巴细胞会有不同变化。因而通过测定T淋巴细胞在外周血液中的数量变化,可为某些疾病的诊断、予后及疗效观察提供参考。然而目前国内关于健康马、骡T淋巴细胞的正常值报道甚少,且很不一致。本试验试图通过对健康马、骡T淋巴细胞的测定,为确定我国健康马、骡T淋巴细胞的正常值提供参考。目前测定T淋巴细胞容易试行的方法有E-玫瑰花环(简称ER)形成试验及T淋巴细胞酯酶染色法等。笔者试图通过对比试验,了解上述两种方法的相关性和可行性,为进一步选出简便易行的测定方法提供参考。为此对60匹健康马、骡进行了T淋巴细胞的测定,现将测     

温氏附红细胞体对奶牛免疫水平的影响

选择5头感染温氏附红细胞体的奶牛和5头健康奶牛,分别进行红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率的测定。结果表明,感染温氏附红细胞体的奶牛其红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率明显低于健康奶牛,且二者在0.01水平上有差异。这说明温氏附红细胞体对奶牛的免疫水平有明显的抑制作用。     

中药复方制剂对奶牛免疫机能的影响

选取30头健康奶牛和30头隐性乳房炎奶牛进行中药复方制剂饲喂试验,对奶牛的B淋巴细胞EAC花环形成率、中性粒细胞吞噬率、中性粒细胞吞噬指数和T淋巴细胞转化率进行测定,观察中药复方制剂对奶牛免疫机能的影响.结果显示,健康奶牛的EAC花环形成率、中性粒细胞吞噬率、中性粒细胞吞噬指数、T淋巴细胞转化率均显著高于隐性乳房炎奶牛(P＜0.01或P＜0.05);中药复方制剂可以显著提高健康奶牛和隐性乳房炎奶牛的EAC花环形成率、中性粒细胞吞噬率、中性粒细胞吞噬指数、T淋巴细胞转化率(P＜0.01或P＜0.05).试验表明,中药复方制剂可以增强奶牛机体的体液免疫和细胞免疫功能,促使隐性乳房炎奶牛免疫机能的恢复.     

进口奶牛皮肤真菌病病原疣状毛癣菌的分离鉴定

为了解进口奶牛皮肤真菌病的病原情况,选择2013-2014年河北进口的具有不同程度皮肤真菌病症状的奶牛,刮取病灶处皮屑样品34份,进行病原分离,并通过形态学和DNA条形码方法进行鉴定。结果表明,共分离得到17株真菌,其中10株被鉴定为人畜共患性真菌——疣状毛癣菌。这为进一步了解中国进口种牛皮肤真菌病病原,开展有效治疗,探索疫苗免疫方案以及预防从业者感染奠定了基础。     

Serological visualization of interleukin 2

Interleukin 2, a lymphokine that acts as a second signal of cellular immune response by way of its action as a T-cell growth factor, was morphologically identified by immunoperoxidase staining. With the use of a monoclonal antibody to interleukin 2 and several complex-forming antisera, the lymphokine was readily distinguished in cytocentrifuge preparations of peripheral blood leukocytes stimulated with a T-cell mitogen. When preparations of cloned interleukin 2 producer and responder cells were stained by the same procedures, discrete patterns of both responder and producer cell phenotypes were revealed. Interleukin 2 producer T cells exhibited a characteristic intense, ringlike cytoplasmic staining, whereas the responder cells (as exemplified by interleukin 2-dependent cell lines) exhibited a less intensive, spotlike membrane staining. In addition, intense membrane localization of interleukin 2, reminiscent of potential capping phenomena, could be observed in stained preparations of cloned responder cells.     

兔耳廓软骨的体外培养及细胞特性研究

[目的]研究软骨发育与重建,建立软骨体外培养模式,[方法]通过改良组织块细胞培养法,进行家兔耳廓弹性软骨细胞的体外培养,研究其形态与生长特性。[结果]兔耳软骨组织16 h完成贴壁,1.5 d软骨细胞迁出,144 h细胞生长达到融合;传代兔耳软骨细胞12 h贴壁,生长特性与原代相似,但第3代细胞的延滞期长,在培养48 h开始进入对数期,培养第8天细胞数量达到峰值。HE染色结果表明弹性软骨细胞形态均匀,细胞呈圆形或椭圆形,核呈椭圆形,可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染,胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰。[结论]原代及2代耳软骨细胞体外生长特性及细胞形态一致,培养条件稳定。     

羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡效应

目的探讨羟基磷灰石纳米粒子运载Star3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡作用,并探讨相关机制．方法羟基磷灰石纳米粒子包被的Stat3 shRNA转染到c6胶质瘤细胞内,MTT法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术及吖啶橙染色观察细胞周期分布及凋亡情况,TUNEL染色观察细胞的凋亡及增殖情况．结果羟基磷灰石纳米粒子运载Star3 shRNA转染C6细胞后,呈时间依赖性抑制C6细胞生长和增殖．通过流式细胞术检测证实：该质粒可使细胞阻滞在细胞周期的GO／G1期,细胞凋亡率明显增加（P＜0．05）,与对照组比较差异有统计学意义;吖啶橙及TUNEL染色发现其明显促进细胞凋亡（P＜0．05）,与对照组比较差异有统计学意义;结论羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA体外可明显抑制胶质瘤C6细胞增殖,并促进其凋亡,是治疗胶质瘤较理想的方法．     

SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞及Foxp3基因表达的研究

目的:研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD 4 CD 25 调节性T细胞及Foxp3基因的表达水平,了解它们在SLE发病机制中的作用。方法:分别收集25例SLE患者(SLE组)及健康人(对照组)外周抗凝静脉血,分离纯化T淋巴细胞。PE标记抗CD 4单抗,F ITC标记的抗CD 25单抗,作双色流式细胞术,分析SLE患者外周血CD 4 CD 25 调节性T细胞百分率,RT-PCR检测T细胞Foxp3 mRNA表达。结果:SLE组外周血CD 4 T、CD 4 CD 25 T细胞百分率及T细胞Foxp3 mRNA水平均低于对照组(P<0.01),并且CD 4 CD 25 T细胞百分率与Foxp3mRNA水平呈依赖关系(P<0.01)。结论:SLE患者外周血存在细胞免疫功能失调,CD 4 CD 25 调节性T细胞数量减少和Foxp3mRNA表达下调可能与SLE的免疫学发病机制有关。     

大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的效果

采用大鼠心肌条件培养基对昆明白小鼠胚胎干细胞进行分离、消化传代、培养鉴定等,研究大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的作用效果。结果显示,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠3.5d囊胚胚胎干细胞集落分离中,所分离的昆明白小鼠胚胎干细胞集落具有岛屿状生长,隆起于饲养层上;碱性磷酸酶染色为强阳性;体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;经过常规冻存传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长形态,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;对传至第5代的小鼠胚胎干细胞集落进行核型分析,小鼠胚胎干细胞核型正常率大于75%。试验证实,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养过程中效果较好。     

血管紧张素II对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

为探讨血管紧张素II（angiotensin II,AngII）对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,采用鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,并用油红O染色法和还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide-adenine dinuceotid,NADH）氧化速率法检测了3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂质的累积和甘油磷酸脱氢酶（glycerol phosphatedehydrogenase,GPDH）的活性。结果表明,100 nmol/L的AngII可显著增大3T3-L1前脂肪细胞分化过程中胞浆脂质累积和GPDH活性（P〈0.01）,外源性AngII可促进3T3-L1前脂肪细胞的分化,增加脂肪细胞中脂类合成和储存。     

Effect of Semen vaccariae and Taraxacumogono on CellAdhesion of Bovine Mammary Epithelial Cells

The aim of this study is to reveal the regulation mechanism of the effect of Semen vaccariae and Taraxacu mogono on the cell-cell adhersion molecule, E-cadherin and b-catenin on the proliferation role and secretion function of bovine mammary epithelial cells cultured in vitro. Firstly, the epithelial character of bovine mammary epithelial cells was authenticated using immunofluorescence, then the cell grow curve was observed and investigated after S. vaccariae and T. mogono treatment. On the effect of S. vaccariae and T. mogono, cell adhesion molecules E-cadherin, b-catenin and CycinD1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blotting, respectively. The results showed that the cellular keratin 18 expressed positively and proliferated vigorously after S. vaccariae and T. mogono treament. The mRNA and protein levels of E-cadherin and CycinD1 were remarkably higher (P<0.05) in 36 h after S. vaccariae and T. mogono treatment. The cell proliferation at 36 h was increased significantly (P<0.05). In conclusion, S. vaccariae and T. mogono have a positive impact on the cell proliferation and an effect on the adhesion molecules E-cadherin, b-catenin and CycinD1 in the Wnt signaling pathway.     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

虎纹蛙消化道肥大细胞的组化性质

采用改良甲苯胺蓝(MTB)、阿利新蓝—沙黄(AB-S)、甲基绿—派洛宁(MG-P)、天青Ⅱ—伊红—瑞特、硫堇及PAS-HE等6种组织化学染色方法,对虎纹蛙消化道肥大细胞(MC)的组化性质进行了研究.结果表明:虎纹蛙消化道中食管、胃贲门、胃体、胃幽门、空肠、十二指肠、回肠、直肠等部位均有MC分布;MC呈长梭形、圆形、卵圆形、不规则形,主要存在于黏膜固有层或黏膜下层内,有沿血管和腺泡周围分布的趋向.在6种染色法中,用MTB染色效果最好,MC易定位,组织结构清晰可辨,胞质呈紫红色;其次为AB-S染色,而MG-P及天青Ⅱ—伊红—瑞特的染色效果一般,硫堇染色效果差,PAS-HE染色则不着色.     

小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.