宁波地区南美白对虾桃拉综合症病毒（TSV）的检测与分析

桃拉综合症病毒（Taura Syndrome Virus,TSV）是对虾养殖业危害较严重的病毒之一。应用RT—PCR技术,对2004～2008年在宁波地区收集的1201份南美白对虾样品进行TSV检测,旨在调查了解该地区TSV的流行情况,为科学防控该病的发生提供参考。结果表明,被检样品中,44份样品呈现阳性结果,总阳性率为3．66％,且2004～2008年南美自对虾TSV阳性检出率呈逐年降低的趋势。可见,宁波地区南美白对虾桃拉综合症已得到有效防制。     

桃拉病毒感染对南美白对虾血液学参数的影响简

桃拉病毒（TSV）病是危害我们对虾养殖业健康发展的主要疾病之一,目前仍无切实有效的防控措施。对虾血细胞既是细胞免疫的承担者,又是体液免疫因子的提供者,研究血细胞在Tsv入侵过程中的反应和变化,对提出有效防止TSV方法上有着积极意义。用Tsv粗提液投喂感染南美白对虾,通过RT—PCtk法,显微镜观察法研究了感染后南美白对虾发病死亡率,及总血淋巴细胞数和不同种类血细胞的比率组成变化,并检测了感染前后血浆中超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）活力的变化。结果显示,TSV感染虾发生了60％～80％的死亡率,出现典型的Tsv症状,PCR证实TSV条带为阳性;而对照组仅有少量的虾只发生死亡。在TSV感染2～3d后,对虾总淋巴细胞数,透明细胞数,半颗粒细胞数及颗粒细胞数分别下降了约690／o、76％、60％和70％;而SOD和PO活力分别下降了约25％和68％。这一结果显示Tsv可能通过降低对虾血液学免疫力而实现其高致病性,通过提高对虾血液学指标可有效降低TSV感染的致病力。     

桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。     

大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

采用逆转录环介导等温扩增技术（RT\|LAMP）,建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒（Garlic virus X, GarVX）的快速检测方法。根据GarVX ORF4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒（Garlic virus A, GarVA）、大蒜D病毒（Garlic virus D, GarVD）、大蒜E病毒（Garlic virus E, GarVE）等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT\|PCR方法的10倍。试验结果表明,RT\|LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。     

对虾桃拉综合症病毒(TSV)的分子生物学研究进展

对虾桃拉综合症病毒（Taurasyndrome virus,TSV）是危害对虾养殖的一个重要病原,开展该病毒的分子生物学研究具有重要的应用价值。文章综述了近年来国内外在TSV的病毒分离与鉴别、TSV检测方法的建立与改善、TSV与宿主感染后相互作用机理等方面的研究进展,提出今后应加强对TSV的病毒分离和保存技术、TSV的纯化和攻毒技术、抗TSV相关基因和抗TSV药物等方面的研究,以提高对TSV的预防和控制水平。     

对虾病毒 DNA／RNA 的实时荧光定量RT PCR 同步检测方法研究

为建立同步检测对虾DNA/RNA病毒的实时荧光定量反转录PCR（RTPCR）方法,提高检验检疫工作效率,探索了一种新的实时荧光定量PCR扩增反应程序。结果显示,应用优化的实时荧光定量RTPCR检测4种对虾病毒（白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒,桃拉综合征病毒、黄头病毒）DNA/RNA,扩增曲线形态典型,扩增效率理想（E值分别为1.06、1.07、0.92、0.92）,标准曲线线性良好（r＝1）,重复性一致（标准差0.05～0.46,变异系数0.26％～1.62％）,灵敏度高,且与实时荧光定量PCR相比差异不显著（平均Ct值误差0.04～0.40,t值0.53～2.50,P＞0.05）,检测时间约1h。优化的荧光定量RTPCR可以用于4种对虾病毒DNA/RNA的快速定量检测。     

广西沿海地区对虾桃拉病毒(TSV)检测及假阳性分析

桃拉病毒(TSV)是一种给对虾养殖业造成极大危害的病原。应用RT-PCR方法对采自广西防城港、北海、钦州等地养殖场的疑似病虾进行TSV检测,结果在250份样品中,TSV的检出率为0;有5份病样在目的带位置附近出现明显条带,经测序和NCB I比对,该条带的DNA序列与南美白对虾18S ribosomal RNA 99%吻合。表明广西沿海地区近年来桃拉病的发病率已明显降低,利用国际兽医局O IE推荐的引物检测桃拉病毒有可能造成假阳性。试验结果可为广西TSV的科学检测与防控提供参考。     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立

养殖对虾可混合感染多种病毒,桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)和白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是南美白对虾感染的主要病原体,建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应(PCR)技术可有效防制疫病的爆发。根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的特异性引物,并在四种不同的PCR系统中扩增筛选,在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带,PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合,本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础。     

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用Primer Explorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化.与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应.将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级.该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测.用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断.     

对虾Taura综合征病毒RT-PCR检测方法的改进及应用

Taura综合征病毒（TSV）是世界动物卫生组织（OIE）目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的10^3倍,最低可检测到10fg的TSV RNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。     

对虾Taura综合征病毒RT-PCR检测方法的改进及应用

Taura综合征病毒（TSV）是世界动物卫生组织（OIE）目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的10^3倍,最低可检测到10fg的TSV RNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。     

猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

乐都紫皮大蒜4种病毒多重RT-PCR检测技术的建立

【目的】建立乐都紫皮大蒜4种病毒的多重RT PCR快速检测方法,为大蒜病毒病病原鉴定、脱毒效果验证等提供技术支撑。【方法】根据乐都紫皮大蒜RNA全长转录组测序结果,分别设计洋葱黄矮病毒（onion yellow dwarf virus,OYDV）、大蒜潜隐病毒（garlic latent virus,GLV）、大蒜D病毒（garlic virus D,GarVD）和大蒜X病毒（garlic virus X,GarVX）4种病毒的外壳蛋白特异性引物,筛选不同引物,优化引物用量、模板用量、退火温度等条件,并进行了多重RT PCR的灵敏度检测和12份引进栽培大蒜种质资源的病毒检测。【结果】通过优化筛选,在一个PCR反应体系中实现了OYDV（1 232 bp）、GLV（831 bp）、GarVD（506 bp）和GarVX（116 bp）4种病毒的多重检测,最优反应条件为退火温度55 ℃,模板用量2.5 μL,混合引物用量1.0 μL。多重RT PCR的灵敏度略低于单一RT-PCR。对引进的12份栽培大蒜资源进行4种病毒的多重RT-PCR检测发现,有5份资源存在4种病毒,4份资源存在2种病毒,3份资源存在1种病毒。对7份资源中经多重PCR未检测到的病毒,使用单一RT-PCR进行检测和验证发现,除1份内蒙古资源（NMG）的1种病毒（GarVX）外,多重RT PCR结果与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的大蒜多重RT-PCR体系可靠性强,可用于大蒜病毒的检测与防控     

辽宁一例凡纳滨对虾大规模死亡的病原研究

为对辽宁省盘锦地区2014年出现的大规模死亡凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei展开病原研究,对死虾进行了白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的分析鉴定,提取病虾鳃组织DNA/RNA后,以特异性引物进行WSSV、TSV和IHHNV病毒检测,通过16S r DNA测序及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR对分离菌株QD1进行分类鉴定,并对病虾的鳃、胃、肝胰腺和附肢进行了组织病理切片观察。结果表明:患病对虾WSSV和TSV检测呈阳性;菌株QD1为嗜水气单胞菌,其人工回归感染试验结果显示,分离菌株能使健康凡纳滨对虾致病死亡;组织病理学观察显示,病虾鳃及胃组织出现大量WSSV特征性的病变核,肝胰腺上皮细胞出现严重萎缩,肝胰腺管腔变大,部分肝细胞坏死,肝胰腺管之间结缔组织中血细胞明显增多。研究表明,此次凡纳滨对虾大量死亡为WSSV和TSV两种病毒与嗜水气单胞菌混合感染所致。     

辽宁一例凡纳滨对虾大规模死亡的病原研究

为对辽宁省盘锦地区2014年出现的大规模死亡凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei展开病原研究,对死虾进行了白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的分析鉴定,提取病虾鳃组织DNA/RNA后,以特异性引物进行WSSV、TSV和IHHNV病毒检测,通过16S r DNA测序及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR对分离菌株QD1进行分类鉴定,并对病虾的鳃、胃、肝胰腺和附肢进行了组织病理切片观察。结果表明:患病对虾WSSV和TSV检测呈阳性;菌株QD1为嗜水气单胞菌,其人工回归感染试验结果显示,分离菌株能使健康凡纳滨对虾致病死亡;组织病理学观察显示,病虾鳃及胃组织出现大量WSSV特征性的病变核,肝胰腺上皮细胞出现严重萎缩,肝胰腺管腔变大,部分肝细胞坏死,肝胰腺管之间结缔组织中血细胞明显增多。研究表明,此次凡纳滨对虾大量死亡为WSSV和TSV两种病毒与嗜水气单胞菌混合感染所致。     

不同盐度对斑节对虾幼虾人工感染WSSV及TSV的影响

[目的]探讨斑节对虾幼虾在不同盐度下对白斑综合症病毒-(WSSV)及桃拉综合症病毒(TSV)的敏感性.[方法]在8种不同盐度下对斑节对虾幼虾进行攻毒试验,采用投喂感染的方法人工感染WSSV和TSV,分析不同盐度对斑节对虾幼虾的抗病力的影响.[结果]人工感染WSSV组,当盐度为25时斑节对虾的存活率最高,为41.11％,与其他组差异极显著(P＜0.01).人工感染TSV组,当盐度为25时斑节对虾的存活率为64.44％,与其他组差异极显著(P＜0.01).当盐度为25时,斑节对虾对WSSV与TSV的抗病力最强,斑节对虾对TSV的敏感性不如WSSV的敏感性强.[结论]该研究可为提高斑节对虾的抗病力奠定基础.