宁波地区南美白对虾桃拉综合症病毒（TSV）的检测与分析

桃拉综合症病毒（Taura Syndrome Virus,TSV）是对虾养殖业危害较严重的病毒之一。应用RT—PCR技术,对2004～2008年在宁波地区收集的1201份南美白对虾样品进行TSV检测,旨在调查了解该地区TSV的流行情况,为科学防控该病的发生提供参考。结果表明,被检样品中,44份样品呈现阳性结果,总阳性率为3．66％,且2004～2008年南美自对虾TSV阳性检出率呈逐年降低的趋势。可见,宁波地区南美白对虾桃拉综合症已得到有效防制。     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

对虾桃拉综合症病毒(TSV)的分子生物学研究进展

对虾桃拉综合症病毒（Taurasyndrome virus,TSV）是危害对虾养殖的一个重要病原,开展该病毒的分子生物学研究具有重要的应用价值。文章综述了近年来国内外在TSV的病毒分离与鉴别、TSV检测方法的建立与改善、TSV与宿主感染后相互作用机理等方面的研究进展,提出今后应加强对TSV的病毒分离和保存技术、TSV的纯化和攻毒技术、抗TSV相关基因和抗TSV药物等方面的研究,以提高对TSV的预防和控制水平。     

南美白对虾病害防治技术

一、红体病 “红体”是南美白对虾疾病发生后的一种显著现象，有学者认为它属于“桃拉综合症”，实际上，白对虾在发生病毒性“桃拉病毒”（TSV），细菌性弧菌病以及环境突变情况下，外观上都会出现红体现象。     

对虾桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾桃拉综合征病毒（TSV）结构蛋白基因保守序列,利用Primer Explorer 40软件设计了4条引物,建立桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速（RT LAMP）检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化;同时将建立的RT LAMP检测方法与RT PCR进行比较分析,RT LAMP的检测灵敏度比RT PCR高10倍。结果表明,RT LAMP最适反应在60 ℃恒温条件60 min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果;RT LAMP对感染TSV的对虾检测呈阳性,而对对虾其他常见病原检测均为阴性,具有高的特异性。     

2013年浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况分析

病毒病频发是导致对虾养殖失败的最重要原因之一,为摸清浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况(白斑病毒、桃拉病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒),进一步提高水产苗种质量安全水平,于2013年对浙江省主要的南美白对虾虾苗场进行了病毒携带情况调查,并结合虾苗来源进行分析。检测方法采用国标、行标中的PCR或RT-PCR方法。结果显示,113份南美白对虾苗种来源均为外省,其中福建省58批次,广东省、海南省各26批次,其他地区3批次,共有68份检出病毒,总阳性率为60.18%,其中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)阳性59份,占52.21%;白斑病毒(WSSV)阳性18份,占15.93%;桃拉病毒(TSV)阳性1份,占0.88%,WSSV和IHHNV同时阳性的10份,占8.85%。     

南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立

养殖对虾可混合感染多种病毒,桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)和白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是南美白对虾感染的主要病原体,建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应(PCR)技术可有效防制疫病的爆发。根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的特异性引物,并在四种不同的PCR系统中扩增筛选,在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带,PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合,本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础。     

桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。     

对虾Taura综合征病毒RT-PCR检测方法的改进及应用

Taura综合征病毒（TSV）是世界动物卫生组织（OIE）目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的10^3倍,最低可检测到10fg的TSV RNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。     

对虾Taura综合征病毒RT-PCR检测方法的改进及应用

Taura综合征病毒（TSV）是世界动物卫生组织（OIE）目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的10^3倍,最低可检测到10fg的TSV RNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。     

感染与未感染桃拉病毒凡纳宾对虾基因差异表达文库的构建

为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆321个,其中攻毒组高表达克隆270个,未攻毒组高表达克隆51个。可见,SPR凡纳宾对虾具有较强的抗TSV能力,以之为基础构建的对虾基因差异表达文库具有高度的可靠性,由文库得到的基因信息对获取对虾抗(TSV)相关基因具有潜在的应用价值。     

广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析

【目的】了解凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）在广西的分布、流行特点及趋势,为研究制定广西对虾IHHN的综合防控措施提供参考。【方法】根据广西凡纳滨对虾养殖情况,分别在北海市、钦州市、防城港市设立监测区,每个监测区设3-5个监测点,2010-2012年每年5月和9月进行两次采样,应用PCR对采集样品进行IHHNV检测,阳性产物送至宝生物工程（大连）有限公司测序,并与NCBI数据库中的IHHNV序列进行比对。【结果】2010年共检测凡纳滨对虾298份,IHHNV阳性率62.1%;2011年共检测凡纳滨对虾300份,IHHNV阳性率44.3%;2012年共检测凡纳滨对虾299份,IHHNV阳性率32.1%;3年的检测结果均以北海市的IHHNV感染率最高。2010、2011和2012年虾苗和中成虾的IHHNV阳性率分别为49.6%和72.1%、35.5%和49.2%、27.3%和36.9%。2010、2011和2012年5月和9月的IHHNV阳性率分别为53.2%和71.8%、35.2%和50.6%、21.6%和37.0 %。【结论】2010-2012年IHHNV在广西凡纳滨对虾主要养殖地区均有不同程度的流行,且中成虾IHHNV阳性率高于虾苗,每年9月的IHHNV阳性率高于5月,但广西近年通过严格控制亲虾品质及引进无病毒感染种苗,凡纳滨对虾品质已得到提升,IHHNV感染呈逐年下降的趋势。     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析

为了解广西养殖凡纳滨对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的感染流行情况,并探讨WSSV广西株缺失区ORF23/24基因的遗传进化差异及其与各地WSSV毒株间的遗传进化关系,2010年5月至2013年9月在广西凡纳滨对虾主产区北海、钦州和防城港共采集306份患病虾样品,应用世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式聚合酶链式反应(nested-PCR)方法进行WSSV检测;选取第一轮PCR为阳性的53份样品进行缺失区ORF23/24基因的PCR扩增,并将12份阳性PCR产物进行克隆、序列测定与比较分析。结果显示:306份患病虾样品中有82份为WSSV感染阳性,阳性率为26.8%;12株WSSV广西株缺失区ORF23/24基因大小均为2 096 bp,相对于此区域最为完整的WSSV-TW株,广西株均在中间缺失了10 970 bp;12株WSSV广西株的缺失区ORF23/24基因差异小,核苷酸同源性均在99.6%以上,仅存在少数碱基的替换,没有缺失和插入,其中BH-3、QZ-1、FCG-1和FCG-2的核苷酸序列完全一致;基于缺失区构建的系统发育进化树显示,WSSV广西地方株在遗传上相距较近,全部与印度株IN-05-Ⅰ聚在一个大的分支,而与台湾株、中国株及韩国株在遗传上相距较远。研究表明,WSSV感染在广西凡纳滨对虾主要养殖地区存在一定程度的流行;广西WSSV毒株缺失区ORF23/24基因的变异类型为中间大片段缺失,各毒株间无明显的地域和时间差异;WSSV广西株与印度株IN-05-Ⅰ的遗传进化关系最近。     

添加不同构型肉碱对对虾生长和体成分含量的影响

研究了在饲料中添加不同构型肉碱对斑节对虾和凡纳对虾生长、饲料利用以及虾体组成成分的影响。在斑节对虾基础饲料(对照组)中分别添加L 肉碱(100、200、300mg/kg),DL 肉碱(100、200、300mg/kg);在凡纳对虾基础饲料(对照组)中添加L 肉碱,添加量分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg和300mg/kg。实验用斑节对虾和凡纳对虾体重平均为0.85g,每个处理设3个重复,每个养殖单元放养对虾40尾,实验为期1个月。试验结果表明,在饲料中添加L 肉碱或DL 肉碱,对斑节对虾和凡纳对虾的生长以及饲料利用均无显著影响(P>0.05);在斑节对虾的试验中添加300mg/kg的L 肉碱或DL 肉碱使虾体脂肪含量由4.69%(对照组)降低为3.47%和3.55%(P<0.05)。在凡纳对虾的试验中,添加L 肉碱200mg/kg、300mg/kg组,虾体脂肪含量由7.09%(对照组)降低到6.04%和5.72%(P<0.05)。     

添加不同构型肉碱对对虾生长和体成分含量的影响

研究了在饲料中添加不同构型肉碱对斑节对虾和凡纳对虾生长、饲料利用以及虾体组成成分的影响。在斑节对虾基础饲料(对照组)中分别添加L 肉碱(100、200、300mg/kg),DL 肉碱(100、200、300mg/kg);在凡纳对虾基础饲料(对照组)中添加L 肉碱,添加量分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg和300mg/kg。实验用斑节对虾和凡纳对虾体重平均为0.85g,每个处理设3个重复,每个养殖单元放养对虾40尾,实验为期1个月。试验结果表明,在饲料中添加L 肉碱或DL 肉碱,对斑节对虾和凡纳对虾的生长以及饲料利用均无显著影响(P>0.05);在斑节对虾的试验中添加300mg/kg的L 肉碱或DL 肉碱使虾体脂肪含量由4.69%(对照组)降低为3.47%和3.55%(P<0.05)。在凡纳对虾的试验中,添加L 肉碱200mg/kg、300mg/kg组,虾体脂肪含量由7.09%(对照组)降低到6.04%和5.72%(P<0.05)。     

南美白对虾稚虾暂养期间传染性疾病的控制方法

阐述了近几年北方南美白对虾在稚虾暂养时出现的传染性疾病,分析了该疾病的发病原因,提出了在暂养过程中以预防为主治疗为辅的方法,以消毒剂、抗生素制剂、抗应激添加剂、微生物制剂相结合的防病治疗方法。指出在南美白对虾苗种的选择上一定要考虑亲本的来源,以及对稚虾要进行病毒检测。     

3种菊酯类农药对南美白对虾同工酶表型的影响

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对注射不同浓度菊酯类农药的南美白对虾Penaeus vannamei3种组织的酯酶同工酶(EST)和苹果酸脱氢酶同工酶(MDH)进行了分析比较。结果表明：经农药胁迫后，虾体内各组织同工酶酶带出现明显的变化，在不同浓度下存在明显的差异，并具有明显的组织特异性。由于不同种农药的作用结合位点不同，使得酶带变化规律也不相同，当虾体被注射农药后，EST酶带变化较复杂，而MDH酶带则较稳定。当虾体受到农药胁迫时，可引起虾体无氧代谢加强，有氧代谢和酯类降解代谢减弱，正常的物质代谢平衡被破坏，因而使供给机体的能量减少，机体的免疫力和抵抗外界环境的能力均明显降低；另外，还有可能诱发虾病的暴发或导致虾的大批量死亡。