ABI313Oxl全自动测序仪规模化测序的影响因素研究

[目的]提高利用ABI3130xl全自动测序仪对小麦与条锈菌互作的cDNA文库进行大规模测序的成功率,降低成本.[方法]将BigDye(BigDye(R) Tem1nator V3.1 Cycle Sequencing RR-100)分别稀释16,24和32倍设计测序的PCR反应体系,分析了EDTA溶液(125 mmol/L,pH 7.0)和醋酸钠溶液(3 mol/L,pH 5.2)以及不同模板类型等相关因素对测序结果的影响.[结果]BigDye稀释16倍的PCR反应体系的测序结果易出现染料峰,影响碱基正确读值;稀释32倍体系的测序结果中可用序列短,成功率低;稀释24倍体系测序结果的可用序列长且准确率高,为最佳反应体系.EDTA溶液和醋酸钠溶液可提高DNA纯化的质量,改善测序效果.以质粒DNA为模板测序较PCR产物直接测序效果好,通过控制模板质量可以提高测序成功率.[结论]利用优化体系共测得15 000条ESTs序列,其中有高读长序列13 080条,占87.2%,表明该优化体系简单有效,且可有效节约成本.     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

大麦EcoTILLING技术体系的优化

 【目的】建立适合于大麦的EcoTILLING技术体系,用于鉴定大麦目的基因或特定区域的自然突变。【方法】利用M13通用接头作荧光标记,采用巢式PCR对大麦目的基因进行扩增,从PCR扩增的退火温度及模板量、CELⅠ的用量和酶切处理时间等方面对大麦EcoTILLING技术体系进行了优化。【结果】用于第一次PCR扩增(10 μL反应体系)的大麦基因组DNA模板最佳用量为20 ng,第一次PCR扩增产物稀释3倍后作为第二次PCR扩增的模板,2次PCR扩增的适宜退火温度均为58℃;在20 μL CELⅠ酶切体系中,最适酶量为0.4 μL(3 U•μL-1),45℃条件下最佳酶切处理时间为17.5 min。【结论】优化的EcoTILLING技术体系能有效地发现大麦自然群体中特定区域的DNA多态性,降低了试验成本,为在大麦及其它作物上的广泛应用提供借鉴。     

常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5’端序列的探索

【目的】扩增口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因组5’端序列,为获得基因组全长准备基础。【方法】将FMDV O/Akesu/58 CE39A株液氮冻存基因组RNA反转录三次,对c DNA的5’端序列进行扩增、克隆、测序。【结果】以c DNA1与c DNA3为模板,用LA Taq DNA polymerase、EX Taq DNA polymerase、Prime STARHS DNA polymerase及3对引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均未扩增出5’端目的片段;以c DNA2为模板,用LA Taq DNA polymerase为扩增酶,两对引物Ⅰ、Ⅱ均能扩增出5’端目的片段,且所测得的序列长度787 bp、797 bp与参考序列核苷酸同源性分别为86.2%和86.3%。【结论】常规PCR法扩增5’端序列较其它技术具有价格便宜、操作简便等优点,但扩增成功率偏低。试验共进行了72次PCR,成功率为6/72,说明FMDV 5’端序列的扩增难度大,应合理设计反转录引物和扩增引物。为许多RNA病毒反向遗传学研究提供了更多的选择。     

濒危兰科植物DNA条形码鉴定体系的建立与优化

通过设计濒危兰科植物DNA条形码ITS,matK和psbA-trnH序列的通用引物并对其PCR反应体系进行优化,对16种有代表性的濒危兰科植物进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率。结果表明:ITS,matK和psbA-trnH序列引物对濒危兰科植物的扩增和测序成功率均较高,PCR反应的最佳退火温度分别为ITS 54℃,matK和psbA-trnH 50℃。在上述反应体系和条件下获得的目的条带清晰、明亮,可作为鉴别濒危兰科植物物种的DNA条形码组合。     

猪肌肉组织中ApoE基因5′调控区甲基化的研究

【目的】研究猪肌肉组织中猪载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因5′调控区的DNA甲基化状况。【方法】以180日龄长白母猪为试验动物,采集其肌肉组织,提取其DNA,经亚硫酸氢盐修饰后用作PCR反应模板;通过生物信息学预测猪ApoE5′调控区潜在的CpG岛,根据预测结果选用甲基化特异性引物对CpG岛进行PCR扩增,对回收、纯化的PCR产物进行克隆和测序,并与GenBank中的ApoE5′调控区序列进行比对,分析CpG岛的甲基化水平。【结果】生物信息学预测发现,猪ApoE基因5′调控区有2个CpG岛,第1个CpG岛有10个CpG位点,第2个CpG岛有12个CpG位点;PCR扩增获得长度分别为233bp的CpG岛1和288bp的CpG岛2序列,这2个CpG岛均存在着9个甲基化CpG位点。【结论】猪ApoE基因5′调控区是CpG位点的富集区域,2个CpG岛存在不同程度的甲基化。     

小麦条锈菌MFLP分子标记体系的建立与优化

【目的】建立并优化小麦条锈菌的MFLP技术体系。【方法】以小麦条锈菌混合菌种为材料,通过对DNA提取、限制性内切酶2次酶切、PCR双重扩增等试验因素的选择优化,建立适用于小麦条锈菌的MFLP分析体系。【结果】改良的CTAB/SDS法有较好的破壁效果,所提取的DNA品质良好,完全符合MFLP的操作要求。优化确定的最佳MseⅠ酶切反应时间为4h,预扩增最适退火温度为55℃,选择性扩增使用的模板为预扩增产物的100倍稀释物,其最适退火温度为58℃。【结论】建立的MFLP技术体系可提供清晰、稳定的MFLP指纹图谱,为小麦条锈菌等专性寄生菌的群体遗传学与流行学研究提供了新的技术手段和方法。     

基于DNA条形码基因快速鉴定帕米尔高原南麓部分地区农田叶蝉

【目的】 研究更加便捷高效的鉴定技术,提高叶蝉鉴定的速率,为帕米尔高原南麓部分地区叶蝉的鉴定及防治提供基础数据。【方法】 利用DNA条形码技术,选择mtDNA COI、Cytb、ITS2基因,运用通用引物PCR扩增并直接测序,借助生物信息学分析软件对比分析目的基因序列的相似性,构建系统进化树,分析遗传进化关系,获取叶蝉DNA条形码。【结果】 获得了19条mtDNACO1、Cytb及ITS2基因序列,COI基因6条、Cytb基因7条、ITS2基因6条,可作为叶蝉的DNA条形码,包括其中1条COI新序列,5条Cytb和6条ITS2序列。【结论】 获得19条叶蝉的DNA条形码,实现了帕米尔高原南麓部分地区农田4种叶蝉的快速准确鉴定。     

辣椒细胞质雄性不育相关线粒体基因片段的克隆及序列分析

【目的】探究3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料的不育分子机理,寻找与雄性不育相关的基因。【方法】采用高盐-蛋白酶K法提取辣椒细胞质雄性不育系及其保持系的绿色叶片线粒体DNA(mtDNA),根据已报道的辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,利用PCR反应,从3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料线粒体基因组中均扩增出330 bp左右大小的条带。【结果】经克隆测序及序列分析表明,3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料所获片段序列完全一致,大小为330 bp,命名为CMS330,与orf456核酸序列同源性达99%。【结论】3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料具有相似的不育分子机理。     

木薯SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化木薯SCoT-PCR反应体系并进行SCoT引物筛选,为木薯辅助育种提供技术支持。【方法】以木薯品种新选048为材料,利用正交试验设计对DNA模板量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶量等因素进行优化,确定木薯最佳SCoT-PCR反应体系,并用其进行SCoT引物筛选。【结果】木薯最佳SCoT-PCR反应体系(20.0μL):模板DNA 60 ng,引物浓度0.30μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U,Mg2+1.50 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L。利用该体系筛选出19条SCoT引物,能稳定扩增出数量多、清晰可辨且多态性丰富的条带。【结论】优化的木薯SCoT-PCR反应体系检测结果稳定,重复性好,且筛选出的19条引物均适用于木薯遗传多样性分析。     

鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p~(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P~(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.     

不同年代云南普洱茶DNA提取分离方法初探*

 以不同年代(贮藏时间)的云南普洱茶为原料,通过改进的CTAB方法来提取分离云南普洱茶总DNA,试验表明,所采用的经改进的CTAB DNA微量提取法,可以得到高质量的云南普洱茶DNA。建立了适合云南普洱茶DNA的提取方法,为进一步研究云南普洱茶贮藏年代的遗传图谱奠定了基础。     

硅胶干燥旱稻叶片制备DNA样品及其RAPD反应体系的建立

进行了硅胶干燥制备DNA样品和RAPD反应体优化的研究。结果表明：①用硅胶干燥的旱稻叶片可制备出高质量的DNA样品。所提取的DNA样品的OD260／OD280（对波长260nm与280nm光线的吸光度的比值）为1.7-1.9，OD260／OD230＞2，DNA分子质量为30.6Mu左右，产率在50－170μg/g，DNA完整性较好，能够成功用于RAPD扩增。②确立旱稻最佳的PCR反应体系是50－100ng DNA模板，1.2U的Taq酶，2.5mmol/L的Mg^2 ，0.25mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，10mmol/L Tris-Cl(pH8.0），50mmol/L KC,0 .1％明胶，反应终体积20μL。     

一种有效抽提蚕、桑DNA的方法

生物技术的发展给实验理论和生产实践带来了新的突破 ,分子生物学技术的广泛应用使蚕桑生产出现了新的突破点与希望 .目前 ,几乎所有的家蚕生理、生化方面的研究都深入到分子生物学 ,对透彻了解和掌握家蚕的生长发育起着举足轻重的作用 .如限制性酶切片段长度多态性 (ＲＦＬＰ) ,随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ) ,串联重复序列 (ＳＳＲ) ,扩增酶切片段长度多态性 (ＡＦＬＰ)等方法 ,除了应用于家蚕外 ,也可广泛应用于桑树的分子生物学研究 .因此 ,在试验与研究过程中 ,探讨摸索一条适用于可同时提纯桑树、家蚕的动植物ＤＮＡ的方法对研究工…     

大豆DNA提取基本原理的探讨

大豆 DNA提取是进行大豆分子生物学研究的基础。大量、高质量的 DNA提取一直是大豆科学研究者探讨的问题。根据实验经验和查阅有关文献总结了大豆 DNA提取各个步骤的基本原理     

3种植物DNA提取法中多糖类物质去除效果的研究

为探明DNA提取过程中去除多糖的有效方法,以丁香属3种植物为材料,用3种DNA提取方法（普通CTAB法、氯苯法和高盐法）提取丁香属植物基因组DNA。对提取的DNA质量采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法进行检测,并采用蒽酮硫酸法测定DNA提取过程中多糖含量的变化。结果表明：3种方法的多糖去除率相近且都比较高。高盐法与前两种方法相比对人体和环境危害较小且操作简单,是最适合该属植物的DNA提取方法。该方法采用了专门的去除多糖的步骤,为DNA提取过程中多糖的去除提供了一定的理论依据。     

纳米材料在DNA电化学生物传感器中的应用

对金属纳米材料、氧化物纳米粒子、碳纳米管、复合纳米粒子等在DNA电化学生物传感器中的应用进行了综述。     

DNA分子标记在植物新品种保护应用中存在的问题与对策

针对目前国内外DNA分子标记技术在植物新品种保护中的应用情况,阐述了我国DNA指纹图谱鉴定结果合法性受到质疑以及检测结果可靠性难以达成共识等问题。认为应从完善申请登记数据、成立独立检测鉴定中心,创造适宜DNA分子标记应用的环境等方面制定相应的规章制度,建立一套较完善的鉴定体系。     

一种适用于动物与植物总DNA提取的方法——改良CTAB法

[目的]介绍一种简单、高效且能用于提取动物与植物的总DNA的方法。[方法]采用改良CTAB法,从24个花生品种嫩叶及小白鼠的肝、肺和肾中提取DNA,进行琼脂糖电泳和蛋白核酸分析仪检测及PCR扩增检验。[结果]所提取DNA电泳条带清晰,整齐均匀,OD260/OD280值介于1.77~1.83,用于PCR扩增获得理想效果。[结论]该研究介绍的改良CTAB法提取动物和植物的总DNA,满足开展PCR扩增的要求。     

白黎芦醇与DNA相互作用研究

[目的]为进一步研究白黎芦醇药理活性提供信息基础。[方法]在pH值为6的Tris缓冲溶液体系中,应用荧光光谱法和紫外光谱技术以及黏度法研究白黎芦醇和DNA分子间的相互作用,计算白黎芦醇与DNA的结合常数和结合位点数。[结果]25℃时,白黎芦醇与DNA之间的结合常数为3．96×10^3L／mol,结合位点数为1．0053,结合方式是白黎芦醇通过嵌入结合的方式与DNA结合,这种结合方式可能是白黎芦醇具有抗癌功效的一个重要因素,即白黎芦醇通过嵌入方式与DNA结合,影响DNA的转录和复制,从而导致癌细胞凋亡。[结论]证明白黎芦醇是以嵌入结合的方式与DNA结合,这种结合方式可能是白黎芦醇具有抗癌活性的一个重要原因。