青海省海北地区牦牛源贾第虫检测与基因型分析

为研究青海省海北地区牦牛贾第虫的感染情况及虫种基因型,对青海省祁连县、海晏县和刚察县的297份牦牛粪样采用蔗糖密度梯度离心法纯化,之后用免疫荧光方法对贾第虫进行鉴定,对阳性及疑似阳性样品采用基于18SrRNA和谷氨酸脱氢酶(gdh)基因的套式PCR扩增,并对扩增产物进行测序。将测序结果与GenBank中的贾第虫序列进行比对分析。免疫荧光抗体试验结果显示,共检出24份贾第虫阳性粪样,总阴性率为8.1%。套式PCR扩增结果显示,24份阳性样品中18SrRNA基因扩增阳性22份,gdh基因扩增阳性18份,产物大小分别为292bp和432bp。序列分析表明,分离的虫种均为牦牛源肠贾第虫,基因型为集聚体E,未发现人畜共患基因型。     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

青海省海晏县犬粪样中贾第鞭毛虫的检测

从青海省海晏县采集10只牧羊犬粪样用于贾第鞭毛虫检测.所有样品经饱和盐水浓缩法和蔗糖密度梯度离心等方法处理后采用光学显微镜、免疫荧光试验(IF)和套式PCR方法进行检测.结果显示,其中1个样品为阳性(10％),PCR扩增片段长度为274 bp,命名为QHGC201101株.测序结果与肠贾第鞭毛虫3VR株(HQ616609)核糖体小亚基RNA的同源性为100％,表明分离的虫种为肠贾第鞭毛虫,属于人兽共患型病原.     

水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒(AMDV)纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,此纳米PCR的最佳退火温度为51℃,普通PCR为55℃;加入胶体金最佳浓度在0.2~0.8nmol·L-1,纳米PCR与普通PCR产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米PCR方法只扩增AMDV而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米PCR敏感性比普通PCR高10倍。检测40份临床样品,结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高,从而为用粪、尿等低病毒样品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。     

牛源蓝氏贾第虫环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为建立一种适用于牛场或基层单位的牛源蓝氏贾第虫快速检测方法,根据NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的蓝氏贾第虫基因序列设计外引物(FIP,BIP)、内引物(F3,B3)和环引物(LB),建立了牛源蓝氏贾第虫的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并对采集的40份犊牛新鲜粪便样品分别采用巢式PCR方法(贾第虫检测金标准)和建立的LAMP检测方法进行蓝氏贾第虫检测。结果显示：建立的牛源蓝氏贾第虫LAMP检测方法特异性良好,灵敏度高于巢式PCR;2种方法检测结果的符合率为100%。结果表明：所建立的LAMP检测方法可用于农场或基层单位的牛源蓝氏贾第虫检测。     

犬源A型贾第虫real-time PCR检测方法的建立

为建立贾第虫定性定量的检测方法,本研究针对犬源贾第虫16S rRNA基因片段设计一对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了贾第虫DNA的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为94.20℃,最低可检测到3.39 copy/μL的阳性质粒,标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见原虫隐孢子虫、球虫、弓形虫均不发生交叉反应,重复性变异系数小于3％.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为贾第虫病的临床检测和流行病学调查提供了新的技术手段.     

牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

斑点免疫结合试验对蓝氏贾第鞭毛虫感染者粪中特异性抗原的检测

应用蔗糖密度梯度离心技术从蓝氏贾第鞭毛虫感染者的粪便中分离纯化贾第虫包囊，以此包囊免疫家兔，获得免疫血清，经大肠杆茵吸收后建立斑点免疫结合试验，检测粪中贾第虫特异性抗原。以此法检测３９例贾第虫感染者粪便，有３６例出现阳性斑点，阳性检出率为９２．３％。以超声粉碎的贾第虫包囊抗原为标准，３６例阳性标本中，有３５例标本贾第虫特异性抗原蛋白含量分布在３９～６９ｎｇ／ｍＬ范围内，１例为１３８ｎｇ／ｍＬ。     

青海牦牛源贾第虫的鉴定及分子特征分析

从青海省祁连县采集93份牦牛粪样用于贾第虫检测。所有样品经蔗糖密度梯度离心法纯化处理后,采用卢戈氏碘液染色镜检和免疫荧光试验进行检测,将镜检阳性样品采用套式PCR方法扩增18S rRNA,并对扩增产物进行测序分析。结果镜检和免疫荧光试验中有9份样品为贾第虫阳性,阳性率为9.7%。镜检阳性样品采用套式PCR方法扩增后有8份样品为18SrRNA基因阳性,产物长度292bp,测序后的序列分别命名为QHQL201501~QHQL201508。系统发育分析显示,分离的虫株属于牛源十二指肠贾第虫,基因型均为反刍动物特有的聚集体E,未发现具有人兽共患潜力的A型和B型。     

安徽省部分地区猪贾第虫PCR检测及阳性株的分子特性

为了解安徽省规模化猪场贾第虫感染情况及分子特性,从安徽省多地共采集500份新鲜猪粪样,提取基因组DNA,首先采用基于蓝氏贾第虫SSUrRNA基因套式PCR对所有粪便进行检测,并对获得的阳性样本分别基于贾第虫TPI和GDH基因的PCR扩增,然后对获得的PCR产物进行测序和分析,确定贾第虫的聚集体。结果显示,500份猪粪便样品中,SSUrRNA基因套式PCR仅在利辛猪场检测出1例贾第虫阳性样本,猪贾第虫阳性率为0.20%。TPI和GDH基因的测序分析显示该贾第虫基因型为聚集体E。     

隐孢子虫和贾第鞭毛虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

本研究根据隐孢子虫和贾第鞭毛虫相对保守序列,设计2对引物及其相应的Taqman探针,通过对引物和探针浓度、Taq酶以及反应条件等优化筛选后,建立了能同时检测隐孢子虫和贾第鞭毛虫的双重实时荧光PCR方法。所建立的隐孢子虫和贾第鞭毛虫双重荧光PCR检测方法的灵敏度为10-9,相当于46.1copies/!L,重复性好,特异性佳。本研究建立的双重荧光PCR技术,可以快速、准确地于一管一次反应检测隐孢子虫和贾第鞭毛虫。     

两株犬源贾第虫tpi基因的基因型分析

采用巢式PCR鉴定广东两株犬源贾第虫(GD1和GD2)的基因型。运用碘液染色对犬粪便中贾第虫进行鉴定,提取DNA后经巢式PCR扩增tpi基因,扩增产物测序后用BLAST和DNAStar软件进行同源性和系统发育分析。结果表明,通过tpi基因分析,GD1与L02120的同源性为100%,种系发育树上位于同一分支;GD2与DQ220289的同源性为99.1％,种系发育树上两者在同一分支。广东犬源贾第虫GD1为人畜共患的A1型,GD2为犬的D型。     

梨形虫和伊氏锥虫双重PCR检测方法的建立

为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。     

牛巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank发表的XJ-MSA-2c核苷酸序列(登录号:EU328267)设计的2对特异性引物MS-1、MS-2、MS-3以及MS-4,建立牛巴贝斯虫病巢式PCR快速检测方法。在特异性检测试验中,仅从MSA-2c质粒样本中扩增出622、350bp2条目的片段,与预期片段大小相符,而作为对照样本的双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、东方巴贝斯虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现。第1次和第2次扩增的敏感性分别为1.75、1.75×10-2μg/L。在对46份全血的DNA样本巢式PCR和显微镜检测中,阳性检出率分别为34.8%(16/46)和23.9%(11/46)。结果表明,所建立的巢式PCR方法准确、敏感、特异,作为牛巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义。     

宁夏部分地区奶牛贾第鞭毛虫分子流行病学调查

为了明确宁夏地区奶牛贾第鞭毛虫的优势基因型及其流行特征，试验首先于宁夏地区10个规模化奶牛养殖场采集880份奶牛粪便样品，针对贾第鞭毛虫保守基因——β-贾第素(β-giardin, βg)基因序列设计引物，然后以提取的粪便样品全基因组DNA为模板进行巢式PCR,将PCR产物的测序结果进行BLAST比对分析，鉴定贾第鞭毛虫的基因型，并建立系统进化树，最后对宁夏地区不同城市、不同月龄及腹泻和非腹泻奶牛粪便样品的感染阳性率和基因型进行统计。结果表明：880份粪便样品中，有145份样品扩增到大小为510 bp的条带，贾第鞭毛虫感染阳性率为16.5%(145/880),其中集聚体A的占比为1.4%(2/145),集聚体E的占比为98.6%(143/145);所有集聚体A的βg基因为1种序列(已上传至GenBank,登录号为OQ101261 1NX),所有集聚体E的βg基因为4种序列(已上传至GenBank,登录号分别为OQ101262 2NX、OQ101263 3NX、OQ101264 4NX和OQ101265 5NX);OQ101261 1NX(奶牛)与MK5773339.1(藏牛)、MF49...     

犬源贾第虫EF1α基因的克隆及序列分析

以广州某宠物医院临床犬源贾第虫为研究对象,根据GenBank TM中登录的贾第虫EF1α基因序列(AF069575),设计1对引物EF/ER,采用PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对其进行序列测定及分析,旨在对广州犬源贾第虫进行分子鉴定。结果显示,该犬源贾第虫EF1α序列长为288bp,与预期目的片段一致,该序列构建的分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。说明EF1α适合做分子标记,可准确地对贾第虫进行基因分型,为贾第虫分子分类学及分子遗传学研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法建立

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原体.为建立一种灵敏度更高且特异性更强的分子检测技术,研究建立一种猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测技术.首先利用梯度PCR方法验证内外引物的最佳退火温度;再利用正交试验设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓...     

犬源贾第虫β-贾第素基因的克隆及序列分析

为了鉴定犬源贾第虫佛山分离株的基因型,根据GenBank中登录的贾第虫β-贾第素(bg)基因序列(X85958),设计2对引物GF1/GR、GF2/GR,采用套式PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD18-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序,然后进行序列分析。结果显示,犬源贾第虫bg序列长为384 bp,与预期目的片段一致;分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。该基因型在我国为首次报道,为贾第虫的分子鉴定以及分子遗传学研究奠定了基础。     

奶牛乳房炎病原菌多重PCR检测方法的建立

为了同时检测奶牛乳房炎多种病原菌,试验采用金黄色葡萄球菌(S.aureus)nuc基因、牛支原体(M.bovis)oppD/F基因、大肠杆菌(E.coli)16S-23S rRNA基因内转录间隔区作为靶标设计3对特异性引物,在优化单菌退火温度的基础上确定多重PCR的退火温度,建立S.aureus、M.bovis和E.coli的多重PCR检测方法,验证多重PCR的重复性、特异性、敏感性及实用性。结果表明:基于单一PCR三者共同的最佳退火温度(55.3℃、56.5℃、57.8℃)优化多重PCR退火温度,最终确定57.8℃为三者最佳的退火温度。该方法能扩增出长度为237 bp(S.aureus)、333 bp(M.bovis)、634 bp(E.coli)的基因片段;靶标菌特异性扩增而非靶标菌无扩增条带,最低检测浓度分别为S.aureus 1 pg/μL、M.bovis 1 pg/μL、E.coli 100 fg/μL;正常乳样和临床乳房炎乳样均检出S.aureus(25.9%、53.8%)、M.bovis(10.3%、17.9%)和E.coli(32.8%、71.8%),但乳房炎乳样的阳性检出率高于正常乳样。说明本研究建立的多重PCR方法特异性和敏感性强、稳定性和实用性高,具有良好的推广应用前景。