鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

禽呼肠孤病毒C-98、T-98分离株S2基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株(ARV 176)S2基因设计引物,对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98和禽呼肠孤病毒天津地区分离株T-98进行总RNA的提取,以其为模板,应用RT-PCR方法扩增病毒S2基因的cDNA片段,将纯化的cDNA片段克隆到pEASY-T1载体后进行序列测定。结果表明,获得的ARV C-98和ARV T-98的S2基因全长为1324bp,包括15bp的5′非编码区和58bp的3′非编码区,阅读框位于5′端第16位核苷酸和第1266位核苷酸之间。ARV C-98和ARV T-98分离株S2基因的核苷酸同源性很高,达到了99.8%,将C-98、T-98株的S2基因核苷酸序列和参考毒株的S2基因序列进行同源性分析,结果表明,ARV C-98和ARV T-98分离株的S2基因与参考毒株ARV 176、ARV 918、ARV 919、ARV 1733、ARV GX2010、ARV S1133和DRV YJLS2基因的核苷酸同源性最高,在99.2%～99.8%之间;与参考毒株ARV 138和ARV AVS-BS2基因的核苷酸同源性在92.1%～94.1%之间;与参考毒株ARV601SI、ARV 916和ARV 1017-1S2基因的核苷酸同源性在87.3%～87.8%之间;与参考毒株DRV 091、DRV S12和DRV S14 S2基因的核苷酸同源性在77.3%～78.2%之间;与参考毒株MRV 3、MRV 3-jin-1和MRV 3-T3D S2基因的核苷酸同源性最低,在2.4%～5.5%之间。遗传进化树分析显示:ARV C-98和ARV T-98分离株与参考毒株共分为4个遗传进化分支。     

鸡病毒性关节炎病毒B-98株S1基因的克隆与序列分析

本试验对鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）包头地区分离株（B-98株）进行总RNA的提取。参考GenBank中ARV—S1133株s1基因组序列设计两对引物，应用RT—PCR技术特异性地扩增病毒的S1基因的eDNA片段，将s1基因eDNA克隆到pGEM—TEasy载体后进行测序。ARVS1基因包含3个开放阅读框（ORF1，ORF2和ORF3），分别编码P10、P17和SigmaC蛋白。应用计算机软件把所测得的序列与参考毒株ARV-176，ARV-138，ARV—S1 133，Muscovy duck reovirus strain YJL（MDRV—YJL）的s1基因3个阅读框的核苷酸序列进行比较分析。结果表明：AVAVB-98株与ARV-176株P10、P17和SigmaC蛋白的核苷酸序列的同源性最高，与ARV—S1133株、MDRV—YJL株的同源性次之，与ARV-138株的同源性最低。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株S3基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒S3基因序列设计一对引物,以禽呼肠孤病毒内蒙古分离株(C-98)基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法获得病毒的S3基因,并克隆到pMD19-T载体后测序。应用计算机软件将所测定序列与参考毒株ARV 176、ARV S1133、ARV 138的S3基因序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.8%,99.6%,87.7%,推导其氨基酸同源性分别为99.5%,98.9%,94.8%。应用PHD程序和DNAStar软件,对S3基因所编码的σB蛋白结构进行预测,结果表明,σB蛋白为结构紧密的球状蛋白分子。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株L1基因的克隆与序列分析

参考禽呼肠孤病毒S1133株（GenBank）L1基因序列设计3对特异性引物,采用RT-PCR方法对禽呼肠孤病毒内蒙古分离株C-98的L1基因进行了克隆和序列测定。结果表明：获得的C-98 L1基因全长3959 bp,其中包括21 bp的5’非编码区和56 bp的3’非编码区,阅读框位于5’端第22位核苷酸与3’端第3903位核苷酸之间。将C-98株与国内外禽呼肠孤病毒群和哺乳动物呼肠孤病毒群的不同分离株进行序列比较,结果显示：C-98与台湾地区分离株919和美国分离株1733、2408、S1133亲缘关系最近,其核苷酸同源性分别为99.8%、99.7%、99.7%、99.4%;与哺乳动物呼肠孤病毒L3基因核苷酸及其编码的氨基酸同源性较低,为43%～45%。     

2015年-2016年度南宁部分地区猪戊型肝炎病毒基因型分析

为了解广西猪群中戊型肝炎病毒(HEV)基因型,利用套式RT-PCR用对南宁周边猪场采集到的104份新鲜猪粪便进行HEV检测、分离并成功扩增和克隆了11株阳性毒株的ORF2基因部分保守片段.序列测定结果表明,11株HEV ORF2序列自身核苷酸同源性为97.7%~100%,推导编码的氨基酸同源性为97.9%~100%;与4型HEV代表毒株Ch-S-1、Ch-T11、swGX40等的核苷酸同源性为84.6%~90.6%,而与其他各型之间的同源性较低.系统发育进化树结果表明,11株HEV广西株为基因4型,其中,10株HEV为4a亚型,1株毒株为4e亚型.结果表明,广西猪群中流行的HEV均为基因4型,且以4a亚型为优势流行毒株.     

鸡传染性支气管炎病毒GZ株的分离鉴定及3CL~(pro)基因片段序列分析

从福建某鸡场发病鸡的气管和肾脏组织中分离到1株病毒,通过病毒对SPF鸡胚的致病性特征、血凝特性、电镜观察及RT-PCR鉴定等方面的研究,证实该病毒为鸡传染性支气管炎病毒(IBV),并命名为GZ毒株。通过RT-PCR对该毒株的3CLpro基因片段进行扩增,随后进行克隆与测序。该序列与参考毒株的核苷酸序列分析显示,GZ株的3CLpro基因片段与参考毒株的同源性为85.9%~98.5%,与Beaudette毒株核苷酸序列同源性最高(98.5%),而与H120株同源性为89.7%,与LX4株同源性最低(85.9%)。遗传演化分析显示,GZ分离株与参考株可以划分为3个群,GZ分离株与Beaudette毒株处于同一分支,而与LX4、BJ及Massachusetts毒株亲缘关系较远。     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

传染性支气管炎病毒的分离及其S1基因高变区Ⅰ的遗传变异性分析

应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西某一鸡场两群分别为48日龄和7日龄疑患传染性支气管炎的鸡中分离到两株传染性支气管炎病毒(IBV)(分别命名为GX-NN1和GX-NN2);利用反转录-聚合酶链式反应技术对分离株S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)进行扩增并测定其核苷酸序列,以分析分离株遗传变异的情况。结果表明,两个分离毒株HVRⅠ核苷酸之间的同源性仅为76.3%,分离毒株与参考毒株的同源性在69.3%～99.1%之间;其中分离株GX-NN2与疫苗株H120、H52、Ma5、D41和标准株M41、Beaudette的同源性比较高(95.6%～99.1%),同属一个分支;而分离株GX-NN1则与这些参考毒株的同源性比较低(74.6%～75.4%),独自成为另一个分支。本研究的结果提示,广西养鸡业现场流行的IBV毒株已经发生了变异。     

广西狂犬病野毒株L基因3'端的多态性分析

为了解狂犬病病毒(RV)的变异情况,本研究对广西不同地区的22个RV分离株的L基因3'端片段进行克隆和测序,与国内外发表的RV街毒、固定毒株及类RV株相应部分的多态性进行了比较分析.结果表明.所测定的22个广西RV野毒分离株属于基因I型,可分为3个群即I群、Ⅱ群和Ⅲ群.其中13株属于I群,其核苷酸同源性为96.9%～100.0%,氨基酸同源性为98.2%～100.0%;8株属于Ⅱ群,株核苷酸同源性为96.5%～99.7%.氨基酸同源性为97.8%～100.0%.仅1株属于Ⅲ群.22个RV分离株与RV固定毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79.5%～86.9%和85.8%～96.5%,与类RV核苷酸和氨基酸的同源性分别为65.7%～70.3%和70.4%～76.5%.     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析，为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考，也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI，APMVx）基因组序列，设计了1对特异性引物，用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段，并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明，从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒，分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F，与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明，分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株，属于基因I型是传统型毒株，广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

猪细小病毒L株VP2基因片段的克隆及序列分析

对自行分离的PPVL株VP2基因片段进行克隆和测序。序列分析表明:L株VP2基因片段与其他PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99.19%以上,氨基酸同源性在98.87%以上。表明L株与国内流行毒株之间同源性极为接近,其中与NADL-2(4973)株的亲缘关系最近(核苷酸同源性为99.81%,氨基酸同源性为99.62%)。在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),L株与NADL-2株相同,据此推测L株的毒性与组织嗜性可能与NADL-2相似。     

蓝舌病病毒血清1型野毒株及疫苗株S10基因差异

蓝舌病病毒血清型 1型是主要致病血清型之一。为明确其流行规律的分子生物学基础 ,采用 RT- PCR扩增和序列测定技术分析了 15株野毒株及 1株弱毒疫苗株的 S10全基因片段 ,并对其核苷酸和氨基酸差异进行了比较。所有毒株 S10基因核苷酸长度均为 82 2 bp,含有 2个起始密码子 (核苷酸 2 0～ 2 2和 5 9～ 6 1)和 1个终止子 (核苷酸 70 7～70 9) ,预测编码 2种蛋白 (NS3和 NS3A)。不同毒株间 S10基因核苷酸差异为 0～ 138个 (同源性 10 0 %～ 82 %) ,NS3/NS3A蛋白氨基酸差异为 0～ 15个 (同源性 10 0 %～ 93%)。基于 S10基因序列分析 ,可将蓝舌病病毒野毒株及疫苗株分为 2个基因群 :12株野毒株及 1株疫苗株为基因 群 ,3株野毒株与澳大利亚 型毒株属于基因 群 ,两群间的核苷酸同源性为 79%。各基因群在地域分布及宿主来源上未发现有明显的特征性。基因群与毒株分离年代、对 BHK- 2 1细胞毒力等特征关系亦不明显。     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因的克隆与序列分析

提取羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)总DNA,参考GeneBank中OrfVirus(StrainNZ2)株B2L基因序列设计1对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的B2L基因的片段,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,得到该病毒B2L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV-SAOO、StrainNZ2、OV-IA82、N86.20a、N94.10m、No03.8Rt的B2L基因序列进行比较。结果表明,羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株与StrainNZ2同源性最高,达97.9%,与N86.20a同源性最低,为84.2%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征

为了调查2006-2008年山东省鸡传染性支气管炎的分子流行病学特征,应用RT-PCR方法分别扩增了14株传染性支气管炎病毒地方毒株S1基因和N基因,并进行了基因克隆与测序工作.对此14株病毒的S1基因序列利用限制性内切酶HaeⅢ进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果显示可以将IBV毒株分为3种不同的基因型.其中11个毒株与LX4毒株有相同的RFLP分型,2株病毒属于Mass基因型,1个毒株有特异的RFLP分型.并将这些分离毒株与11个参考毒株分别进行了基因与氨基酸系统进化树关系分析.S1基因分析结果显示将这些毒株分成3个基因型,与RFLP分析的分型结果一致.11株病毒同属于LX4类型的毒株,分离毒株核苷酸序列相互之间有95.4%～99.7%的同源性.基因Ⅱ型与疫苗株H120和M41的同源性很高.属于基因Ⅲ型的1个毒株形成了独特的基因型.N基因分析结果表明:12株病毒与LX4属于同一基因型,有着较高的同源性.另2株病毒与疫苗株H120同源性很高.以上分析结果表明:山东省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是山东省IBV变异株产生的另一主要原因.     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)GIF基因的克隆及序列分析

参考GenBank中羊传染性脓疱NZ2毒株GIF(GM-CSFinhibitory factor)基因序列,设计合成特异性引物,以羊传染性脓疱病毒内蒙古分离毒株(OV/nm-05)为模板,提取总DNA,用PCR技术特异扩增出该毒株GIF基因片段,将其克隆到pEASY-T1载体,鉴定后测序。应用计算机软件将OV/nm-05基因测序结果与参考毒株OV-NZ2、OV-D1701、OV-IA82、OV-SA00、OV-F07.808R、OV-MUK59/05、OV-F94.848R的GIF基因序列进行比较。结果表明,OV/nm-05与7株参考毒株的同源性分别为95.7%、98.2%、96.7%、95.5%、95.9%、95.5%、95.1%。     

鸡传染性支气管炎病毒我国地方分离株S1基因的分子特征

应用反转录 -聚合酶链式反应 ,以 IBVS1基因的特异性引物从新疆 IBV流行株基因组中扩增出预期的 1 .7kb左右的片段 ,将此PCR产物修饰后插入到克隆质粒 p UC1 9的Sma I位点 ,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。经测序及序列比较 ,与国外参考毒株相比表明新疆 IBV分离株已有分子水平的变异 ,与国内分离株 QX同源性高达 96% ,证明这两个分离株有很高的同源性     

禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT—PCR技术对8株禽呼肠孤病毒（ARV）σNS基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明，所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因，大小为1107bp。经DNAStar软件分析，除R1株外，其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot5．0蛋白分析软件的分析结果表明，σNS蛋白无跨膜区，拥有较多的疏水区和抗原位点，可作为诊断候选蛋白。     

新城疫病毒广西分离株M基因的克隆与序列分析

根据基因库中新城疫病毒M基因核苷酸序列,设计一对特异性引物,对2000年-2003年期间广西分离的11个NDV毒株的M基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定.结果表明,11个NDV广西分离株的M基因都为1 223个核苷酸,含有1个1 095 bp核苷酸阅读框(ORF),编码364个氨基酸.序列分析结果表明,这11个NDV分离株核苷酸的同源性在86%～99.9%之间,推导氨基酸的同源性在89.3%～99.7%之间;11个毒株与国内外其他7个NDV毒株比较核苷酸的同源性在83.3%～98.5%之间,推导氨基酸的同源性在87.4%～98.6%之间.     

9株鸡毒支原体29 Ku多肽基因的克隆与序列分析

根据已发表的鸡毒支原体(MG)S6株29Ku多肽基因序列设计了1对引物,以9株(广西分离株5株、标准株4株)DNA为模板进行PCR扩增,均得到802bp的特异性片段,将9株MG PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒.重组质粒经PCR法和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定了9株29 Ku多肽基因序列,并在基因库中S6标准株的29 Ku多肽基因序列进行分析比较.结果表明,5株分离株与5株标准株29Ku多肽基因核苷酸序列同源性分别为94.4%～99.9%,推导的氨基酸同源性分别为89.7%～99.2%.从各毒株的进化分析表明,5个分离株与标准强毒株S6、A5969、K1501和PG31强毒株间遗传距离较近,而5个分离株与标准株F疫苗株间遗传距离则较远.