牛肠道病毒的分离鉴定

本研究从内蒙古某奶牛场的犊牛粪便样品中分离的一株牛肠道病毒(BEV),命名为BHM26,通过电镜观察显示和分子生物学鉴定,发现病毒粒子在细胞浆中呈结晶状排列,单一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25nm～30nm,无囊膜;病毒的部分3D蛋白编码区和全长3'UTR区段的1 026bpDNA片段的RT-PCR扩增和序列分析表明,其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为71.9%～87%,其中与BEV Wye-3A株同源性最高,为87%.分析表明中国BEV分离株与国外参考毒株具有较大差异.     

牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价

为研究牛细小病毒(BPV)VP2衣壳蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)以及VLPs的免疫原性.本研究以BPV-1型C7-5中国分离株的基因组序列为模板扩增VP2蛋白的编码基因,将其克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coliB J5183内同源重组将VP2基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带BPVVP2基因的重组腺病毒质粒(pAd-BPV-VP2).该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染Ad293细胞,获得重组腺病毒rAd-BPV-VP2,第8代时滴度为107.25 TCID50/mL.间接免疫荧光、westemblot以及电镜观察结果显示,BPV VP2蛋白可以在腺病毒系统中稳定表达,并有效组装VLPs.将rAd-BPV-VP2肌肉注射免疫BALB/c小鼠,结果显示,针对BPV的血清IgG和中和(VN)抗体分别于加强免疫后2周和8周达最高水平,高峰抗体可持续至15周,VN抗体的最高滴度可达1:4 000.此外,与对照小鼠血清相比,免疫小鼠血清中的IL-2、IL-4及IFN-γ含量显著升高(p＜0.05).结果表明,rAd-BPV-VP2免疫小鼠后可以诱导机体产生针对BPV的特异性体液和细胞免疫.本研究为BPV的免疫预防及载体的开发奠定了基础.     

载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价

为了对壳聚糖分子作为佐剂的缓释效果进行免疫学评价,本研究合成了牛冠状病毒DB2毒株N蛋白基因的3'端第487位～1287位碱基,用大肠杆菌对其进行了高效表达,通过SDS-PAGE电泳分离、电洗脱纯化该牛冠状病毒N蛋白(BCV N).以戊二醛为交联剂,采用乳化交联的方法制备空白壳聚糖微球.利用吸附法制备载BCVN蛋白的壳聚糖微球,通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价壳聚糖微球对BCVN的缓释作用和佐剂效应.结果表明,壳聚糖微球的形态较好、表面光滑、分散性较好,平均粒径为6.50±1.77μm,电势分布在36 mV,吸附BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内所产生的免疫效果明显优于唯N蛋白组,说明载BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内具有一定的缓释效果,使N蛋白在体内缓慢释放而长时间诱导抗体的产生,该研究结果为以壳聚糖微球作为疫苗佐剂积累了实验数据.     

我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株G10P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定

应用轮状病毒RNA电泳方法,对内蒙古、黑龙江、新疆、北京、安徽等地共90份犊牛腹泻粪便样品进行检测.在内蒙古和新疆采集的粪样中共检出11份轮状病毒阳性样品,平均阳性率为12%(11/90).阳性样品经RT-PCR分型鉴定,新疆2份和内蒙古5份样品属于G10型,新疆另一牛场的4份样品属于G6型.对所有阳性样品进行病毒分离,获得1株能在MA104细胞上稳定传代的病毒株,经鉴定该分离株属于G10P[11]型轮状病毒,命名为HM26.G10型牛轮状病毒的分离在国内尚属首次.     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

牛轮状病毒基因重配二价减毒疫苗接种怀孕母牛的免疫原性评价

为评价牛轮状病毒(BRV)基因重组二价减毒疫苗(LLR-85和R191株)对怀孕母牛的免疫反应,本研究将RV LLR-85(G10)和R191(G6)株等比例混合后进行乳化,肌肉途径接种怀孕7个～8个月的母牛.采用间接ELISA和病毒中和(VN)试验对接种牛血清抗BRV的IgG、IgA以及VN抗体进行检测.结果显示,接种2周后抗体水平达到峰值,可以使原有的抗体滴度升高4倍～32倍,高滴度抗体可持续约2个月,接种母牛均未发生流产等副反应.犊牛通过饲喂初乳,可以在出生后1d内获得最高水平的血清和肠道粘膜抗体.结果表明,BRV基因重组二价减毒疫苗对孕牛不但具有良好的安全性、而且其高滴度抗体可以通过初乳使新生犊牛获得有效的被动免疫.这些研究结果为该疫苗的临床应用提供了实验依据.     

我国发生Leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎

2009年2月～6月我国某奶牛场发生严重的犊牛多发性关节炎,发病犊牛的症状与最早发生于澳大利亚的犊牛Leachii支原体关节炎非常相似。为确定病原,我们无菌采集2份具有典型症状犊牛的关节液样品进行实验室诊断,2份样品中均检测和分离出支原体。将2个分离菌株的16S rRNA基因和LppA基因与参考支原体菌株进行核苷酸序列比对,发现这2株支原体的16S rRNA基因和LppA基因均与Leachii支原体具有最高的核苷酸序列同源性,分别为99.9%和99.6%。结果显示,本研究分离的2株支原体为Leachii支原体,分别命名为GN407和GN408。综合分析发病犊牛的临床病理学观察和关节液样品的实验室诊断结果,我们确定Leachii支原体为该奶牛场犊牛多发性关节炎的病因。     

我国A群牛轮状病毒感染的血清流行病学调查

为调查A群牛轮状病毒(BRV)在我国不同地区牛群中的感染和流行情况,本研究采用间接ELISA检测2005年～2006年期间在我国12个不同地区收集的1760份牛血清中抗A群BRV抗体。结果显示,其强阳性血清225份(12.8%);中等阳性血清1240份(70.4%);弱阳性血清279份(15.9%);阴性血清16份(1%)。总抗体阳性率高达99%。不同地区强阳性、中等阳性及弱阳性血清所占比例有所不同。结果表明,A群BRV在我国牛群中的感染和流行不但非常广泛,而且极为严重。本研究对我国BRV感染进行了较大规模的血清流行病学调查,其结果可为我国犊BRV腹泻疾病的防制提供重要的依据。     

犊牛腹泻粪样中牛呼肠孤病毒的分离鉴定

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株.RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3:3:4排列.电镜检测结果显示,病毒粒子呈典型呼肠孤病毒粒子形态,直径约70 nm;病毒L1基因保守区段RT-PCR检测及序列分析表明,扩增出的440 bp 目的片段符合预期大小,而且其核苷酸序列与GenBank参考毒株L1基因序列具有较高同源性;S1基因序列分析表明,B-19株属于呼肠孤病毒血清1型(ST1).     

Leachii支原体的致病作用及其传播途径

Leachii支原体最初由Simmons等于1963年在澳大利亚患多发性关节炎犊牛的关节液内分离获得,代表菌株为PG50[1]。之后,该病原菌陆续从患乳房炎的母牛、患关节炎和肺炎的犊牛以及流产胎儿的体内获得分离[2-7]。目前全世界大约有60个leachii支原体分离株,除7株分离于德国、葡萄牙、尼日利亚、法国和中国外,其余所有菌株均分离自澳大利亚。在分类上,leachii支原体作为独立的群,与丝状支原体群和山羊支原体群同属于丝状支原体族成员[8]。