抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng.mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng.mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

高亲和力的农药克百威单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备高亲和力农药克百威单克隆抗体，建立克百威残留免疫检测方法，控制克百威残留，保障人民身体健康与保护环境。【方法】合成克百威半抗原BFNB，用人工抗原BFNB－BSA免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合，经间接ELISA筛选及显微克隆法亚克隆，分离出阳性细胞株，腹水诱导法及辛酸－硫酸铵沉淀法大量制备及纯化单克隆抗体，间接ELISA法测定抗体滴度及亲和力，间接竞争ELISA法测定抗体特异性。【结果】获得1株稳定分泌抗克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3，其培养上清和腹水抗体滴度分别为1﹕2.048×103和1﹕1.024×106，其抗体亚类为IgG1，亲和力常数为2.54×109 L•mol-1，IC50为1.18 ng•ml-1，最低检测限为0.01 ng•ml-1。与克百威降解产物呋喃酚的交叉反应率为4.59×10-4％，另外几种结构类似的氨基甲酸酯类农药的交叉反应率均小于3.0×10-4％。【结论】此抗克百威的单克隆抗体亲合力高、特异性强，为建立克百威简便、快速、特异的免疫检测方法奠定了基础。     

环丙沙星单克隆抗体的制备

【目的】制备环丙沙星(Crprofloxacin,CPFX)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品CPFX残留的快速检测提供技术支持。【方法】采用碳二亚胺法(EDC),将载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)分别与CPFX偶联合成免疫抗原CPFX-BSA和包被抗原CPFX-OVA,经紫外(UV)扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术筛选分泌CPFX mAb的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备CPFX mAb,并对其染色体核型、效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果表明,人工抗原偶联成功;免疫的5只小鼠血清抗体效价均达到了1∶105左右,其中4号小鼠血清CPFX抑制效价较高且IC50最低(17.21μg/L),融合后筛选出1株敏感特异的杂交瘤细胞,命名为3D2。3D2细胞培养上清效价为1∶(1.28×103),腹水效价为1∶(1.6×105)。CPFX mAb对CPFX的IC50为9.95μg/L,对恩诺沙星的交叉反应率为128.39%,与其他同系的喹诺酮类抗生素的交叉反应率很低。【结论】获得了高效价、敏感、特异的抗CPFX mAb,为CPFX残留的快速检测奠定了技术基础。     

二氟沙星单克隆抗体的研制及其免疫学特性的鉴定

采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星(DIF)与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA.采用紫外(UV),凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-DIF免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体(DIF mAB),并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定.结果表明,BSA与DIF偶联成功,分子结合比为1:4.7,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1:3.2x101、1:2.56×102,腹水效价分别为1:2.56×105、1:1.28x105、1:6.4×104.同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数(Ka)分别为2.94×1010L/mol、1.72×1010L/mol和1.35×1010L/mol.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为2.2ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应.通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,适用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验.     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究

【目的】制备磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD)单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行检测。【方法】用重氮化法将SD偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上,合成免疫原BSA-SD和包被原OVA-SD,并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE法进行鉴定。用BSA-SD免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和阻断ELISA法筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立SD mAb细胞株,用体内诱生腹水法制备SD mAb,对SDmAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】BSA-SD人工抗原制备成功,SD与BSA的分子结合比约为10.3∶1;筛选出6B5-E4、6B5-E9、3A5-B4和2H8-G5 4株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶810、1∶256、1∶512、1∶512,腹水效价分别为1∶(8.6×106)、1∶(2.5×106)、1∶(5×106)和1∶(5×106)。6B5-E4株对SD的半数抑制浓度(IC50)为0.54μg/L。SD mAb与磺胺一甲基嘧啶交叉反应率为2.7%,与其他磺胺类药物无交叉反应性。【结论】获得了抗SD效价高、敏感、特异的mAb,可用于SD残留的快速检测。     

抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单抗效价分别为1∶105和1∶2×105,亲和常数分别为2.5×106和2.3×106。制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的亚型均为IgG1类型。【结论】制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体具有较高的效价和较强的亲和力,可用于进一步研究Zhangfei蛋白在机体中的生理作用。     

泰妙菌素混悬注射液在猪体内的药物动力学及生物利用度研究

 【目的】 研究并比较泰妙菌素混悬注射液和泰妙菌素注射液在猪体内的药物代谢动力学特征及生物利用度。【方法】 7头健康猪,按随机拉丁方设计,进行单次给药剂量(10 mg•kg-1 b.w)静注、肌注泰妙菌素注射液和肌注泰妙菌素注射混悬液,高效液相色谱串联质谱法测定猪血浆中泰妙菌素的浓度,罗红霉素作为内标,3P97药动学计算软件处理血浆药物浓度－时间数据。【结果】 猪静注给药的药时数据符合无吸收三室开放模型,主要药动学参数为：t1/2β为2.04±0.23 h,t1/2α为0.39±0.06 h,t1/2π为0.12±0.04 h,Vd 为8.73±1.83 L•kg-1,AUC为3.78±0.52μg•mL-1•h-1,ClB为2.99±0.43 L•kg-1•h-1)。猪肌注泰妙菌素注射液的药时数据符合一级吸收二室开放模型,主要的药物动力学参数分别为：t1/2Ka(0.06±0.01)h,t1/2β(3.67±0.41)h,Tmax(0.18±0.03)h,Cmax(1.32±0.25)μg•mL-1,AUC(2.62±0.21)μg•mL-1•h-1,生物利用度为73.51%。猪肌注泰妙菌素混悬液的药时数据则符合一级吸收一室开放模型,主要的药物动力学参数为：t1/2Ka(0.04±0.01)h,t1/2Ke(2.90±0.43)h,Tmax(0.27±0.03)h,Cmax(0.7±0.11)μg•mL-1,AUC(2.80±0.35)μg•mL-1•h-1,生物利用度为75.73%。t检验比较肌注泰妙菌素注射液和泰妙菌素注射混悬液的主要药动学参数,结果表明,两者除达峰浓度Cmax有显著差异外,AUC、t1/2Ka、Tmax、t1/2Ke和生物利用度均无显著性差异。【结论】泰妙菌素注射混悬液肌注后在猪体内具有吸收迅速,体内分布广,达峰迅速,消除较快的药动学特征。     

黄牛肉中钙激活酶系统的动力学性质#br#

 【目的】阐明牛肉中钙激活酶系统的主要动力学特征。【方法】通过温度、时间、Ca2+浓度、反应时间、酶量、底物浓度等的变化,分析µ-钙激活酶,m-钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白的动力学特性。【结果】随冷冻温度的升高和贮存时间的延长,钙激活酶系统活性都逐步降低,但冷冻处理可以显著降低钙激活酶抑制蛋白的活性,而钙激活酶对冷冻处理不太敏感;µ-钙激活酶达到最大活性一半时所需的Ca2+浓度为50 µmol•L-1,m-钙激活酶为320 µmol•L-1;在测定钙激活酶活性时,反应时间应控制在60 min以内,酶活单位应小于0.45;在以酪蛋白为底物时,m-钙激活酶的Km值为3.185 mg•mL-1,Vmax为0.015 U•min-1,而µ-钙激活酶的Km值为5.320 mg•mL-1,Vmax为0.017 U•min-1。【结论】钙激活酶系统活性受贮藏温度和时间、Ca2+浓度、酶促反应时间、酶量、底物浓度影响明显。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立

【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病,不合理使用导致在动物性食品中残留,严重危害消费者健康,其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs单克隆抗体（mAbs）,建立间接竞争ELISA（icELISA）检测方法,为动物性食品中FQs多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A）,质谱鉴定;分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA）,紫外和红外光谱鉴定是否偶联成功;CPFX-A-BSA 免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和icELISA方法测定多抗血清效价和敏感性,选取抗血清效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合;NS0细胞和脾细胞按1﹕5比例在PEG-1500作用下融合,筛选抗FQs杂交瘤细胞株,并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定;体内诱生腹水法制备mAb,液体石蜡作为诱导剂,每只鼠注射10⁸个杂交瘤细胞;选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb,建立icELISA标准曲线,对icELISA检测方法优化,在鸡肉中添加10种FQs进行测定,将测定结果与HPLC法比较,用SPSS 17.0软件进行显著差异性分析。【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功;3只鼠血清效价均达到1﹕1.28×10⁴以上,2号鼠血清效价最高（1﹕2.56×10⁴）,且IC₅₀值最低（12.92 ng·mL^-1）,选择2号鼠作为细胞融合用鼠;4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏感广谱特异的杂交瘤细胞,分别命名为2H5、3D11、4F4,细胞上清效价分别为1﹕1 600、1﹕1 600和1﹕800,腹水效价分别为1﹕1.6×10⁶、1﹕8.2×10⁵和1﹕8.2×10⁵;icELISA方法的包被原浓度为1 μg·mL^-1,5%猪阴性血清4℃包被过夜,单抗1﹕40 000稀释,山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP） 1﹕8 000稀释;反应温度均为37℃,标准品与单抗同时加入反应15 min,洗板后加二抗反应25 min;显色10 min,2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异性最好,2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219,R²=0.9 782,对10种FQs的IC₅₀值分别为环丙沙星（CPFX）1.67 ng·mL^-1、诺氟沙星（NOR）1.82 ng·mL^-1、培氟沙星（PEF）1.97 ng·mL^-1、恩诺沙星（ENR）1.54 ng·mL^-1、单诺沙星（DAN）2.79 ng·mL^-1、洛美沙星（LOM）3.38 ng·mL^-1、氧氟沙星（OFL）5.50 ng·mL^-1、麻保沙星（MAR）4.40 ng·mL^-1、沙拉沙星（SAR）11.76 ng·mL^-1、二氟沙星（DIF）13.60 ng·mL^-1,与10种FQs的交叉反应率为12.3%-108.4%,与非FQs交叉反应率均低于0.01%,对10种FQs的检测限（LODs）为0.09 ng·mL^-1-0.64 ng·mL^-1。icELISA法鸡肉中10种FQs的回收率为80.5%-91.8%,HPLC法的回收率为85.1%-95.7%,二者变异系数均低于10.0%;两种检测方法差异不显著（P＞0.05）。【结论】该试验获得了高效价、敏感、广谱特异性的mAbs,建立的icELISA方法可用于同时检测鸡肉中10种FQs。     

动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。     

鸡肉中氟苯尼考ELISA检测方法的建立及应用

 【目的】制备抗氟苯尼考（FFC）的高亲和力特异性抗体,建立检测氟苯尼考的间接竞争ELISA新方法。【方法】氟苯尼考分别与牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）经混合酸酐法偶联,得到免疫抗原和包被抗原,其偶联比分别为14.4和14.7。用免疫原FFC-HS-BSA免疫新西兰大白兔获得了效价较高的特异性抗体。建立并优化了间接竞争ELISA检测方法。【结果】抗血清效价为1﹕102 400。最佳包被抗原浓度为0.5 μg?ml-1,最佳抗体工作浓度为1﹕6 400,酶标二抗的工作浓度为1﹕20 000。回归方程Y = -0.1516X + 0.788（R2 = 0.9859）,检测范围为0.18～500 ng?ml-1,检出限为0.18 ng?ml-1,批内和批间平均变异系数分别为4.86%和7.77%。交叉反应试验中,抗血清与FFC结构相似的氯霉素和甲砜霉素交叉反应率分别为0.094%和0.098%,与其它药物交叉反应率均小于0.01%,表明该方法具有很强的特异性。FFC以浓度0.18～500 ng?g-1在鸡肉中添加,回收率为84.14%～106.1%,变异系数为2.1%～5.6%。【结论】成功获得了高效价、高特异性的抗FFC抗体,建立了鸡肉中氟苯尼考残留检测的ELISA方法。结果表明,所建立的检测方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

【目的】胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）是引起猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光（IFA）鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示：1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光（IFA）结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为：一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2（PCV2）均为阴性;最低检测限为10³个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。