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【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子(LYZop22)和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体(pGL3-LYZcw/op22/op)和人溶菌酶过表达载体(pcDNA-LYZcw/op22/op),将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞(BFFC)和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子(RSCU>1.5)和7个低频密码子(RSCU<0.5)对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子(LYZcw),翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍(P<0.01)和1.30倍(P>0.05);而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍(P<0.01)和2.44倍(P<0.01),说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍(P<0.05)和1.5倍(P>0.05),而LYZop则分别提高了22倍(P<0.01)和17.8倍(P<0.01),mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。 相似文献
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钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-Ⅱ)变化。结果显示,SNAT2过表达时,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加,反之,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时,LC3-Ⅱ表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和蛋氨酸(methionine,Met)后,与单一添加Tre组相比,Met+Tre组p-mTOR表达量增加,LC3-Ⅱ表达量降低,胞浆内绿色自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-Ⅱ表达量增多,胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明,SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。 相似文献
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社会经济水平的快速发展和居民消费观念的快速转变对生鲜农产品的质量情况提出了更高的要求,使农产品信息披露与定价问题面临新的挑战。首先,作出合理假设,构建零售商和消费者关于生鲜农产品新鲜度信息披露问题的博弈模型。其次,考虑3种定价策略,分析不同定价函数形式的适用条件及均衡解。最后,通过仿真试验验证相关结论,并对参数改变情况下零售商的定价策略选择给予指导。无论生鲜农产品零售商选择披露或不披露农产品新鲜度信息的策略,博弈模型的均衡解都为消费者选择购买对应策略下的农产品。然而,由于国家相关部门管控趋势的加强及消费者对高质量农产品需求的提高,零售商只有披露农产品新鲜度信息才能实现长远发展。此时,零售商可根据市场反应选择策略、制定价格,以实现利润最大化。即零售商的定价策略选择可遵循如下原则:当消费者对农产品新鲜度的变化较不敏感,而对农产品价格的变化非常敏感时,二阶段型定价策略更有利于零售商实现利润的最大化;但在消费者对农产品新鲜度变化十分敏感的情况下,零售商选择连续型定价策略会更有优势;当不太新鲜的生鲜农产品撤出市场能够使需求价格弹性减小较多时,退出型定价策略会更有利。 相似文献
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本文在总结生鲜冷链物流行业的现状及发展趋势基础上,对生鲜冷链物流中存在的高成本、
低体系化建设以及较低技术水平等问题存在的原因进行剖析,并针对这些问题提出了积极推进冷链
技术提升、加强产业标准化建设、提高仓储管理水平等优化策略。 相似文献
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受猪肉供给偏紧、主要肉类出口国消费低迷等因素影响,2020年我国肉类进口大幅增加,其中猪肉、牛肉和禽肉进口量创历史新高,分别为439万吨、212万吨和155万吨,分别较2019年增长108%、27.7%、95.5%,羊肉进口则小幅下降。国内奶类价格上涨带动乳品进口继续增加,较2019年增10.4%,折合生鲜乳1875万吨。新冠肺炎疫情对肉类出口国生产影响相对较小,但消费低迷等因素导致全球肉类价格指数从2020年第二季度开始低于2019年同期。 相似文献