小鼠H-Y单克隆抗体ELISA检测方法的建立

以纯系 BAL B/ c雄性小鼠脾细胞腹腔注射免疫同系雌性小鼠 9次 ,获得的抗血清经雌、雄鼠脾细胞吸收后用于精子细胞毒性试验 ,测得 H- Y抗血清效价为 1/ 16 0。选取免疫应答最好的雌鼠脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,用精子细胞毒性方法筛选效价较高的细胞株制备腹水 ,建立优化的 EL ISA反应条件。优化后的 EL ISA反应条件为 :抗原4℃过夜 ,加 H- Y抗血清 37℃反应 12 0 m in,加 HRP- Ig G 37℃反应 30 min,加 TMB 2 5℃ 30 min。优化后的 EL ISA与常规 EL ISA比较 ,可以明显降低阴性吸光值 ,检测灵敏度从 1/ 32 0上升为 1/ 12 80     

一种新颖的阳离子非病毒基因载体 Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH 的性能研究

研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能，重点考察其粒度，基因转染效率与细胞毒性，探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪（DSL）、透射电镜（TEM）观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径，Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160～210 nm的纳米复合物，适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI，PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞，应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性，有望成为基因转移的有效载体.     

1株降解黄曲霉毒素B1的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其体外脱毒效果

旨在筛选出能够高效降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的菌株,并对其脱毒活性组分的脱毒效果进行研究,本研究以香豆素为唯一碳源对目标细菌进行初筛,以对AFB₁的降解率为指标进行复筛,并从形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;通过测定该菌株不同发酵组分对AFB₁的降解率,来定位其脱毒活性组分,同时采用CCK-8法测定活性组分降解AFB₁后对LMH细胞毒性,并研究了热处理、紫外线照射、强酸、强碱及蛋白酶K处理对活性组分脱毒作用的影响。结果显示,从样品中初筛分离到24株能够在初筛培养基生长良好的菌株,经复筛从中筛选到一株能高效降解AFB₁的菌株Y1-B1,其AFB₁降解率达到73.2%;经形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析确定该菌为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。对菌株Y1-B1培养物的不同组分进行的脱毒活性研究表明,不同组分对AFB₁的降解率不同,上清液的脱毒能力最强,细菌细胞裂解物的脱毒能力下降明显,菌体悬液和菌体裂解物上清的脱毒能力最差,由此确定解淀粉芽胞杆菌Y1-B1的脱毒能力主要来源于上清液中的某种活性物质;细胞毒性结果显示,与AFB₁对LMH细胞的毒性作用相比,AFB₁被上清液降解后其产物的毒性显著降低。该脱毒活性组分对不同理化因素处理呈现出不同的表现,对高温、紫外照射抵抗力较强,对强酸、强碱抵抗力较差,蛋白酶K仅造成脱毒能力部分减弱。本研究将为解决黄曲霉毒素污染问题提供新的微生物种质资源,同时为后续微生物脱毒制剂的开发奠定基础。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b（＋）原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组（P〈0.01）,分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍（P〈0.01）,而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化（P〉0.05）。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。     

杀菌剂丙环唑对斜纹夜蛾的生物活性

为从现有农药中寻找杀虫剂先导化合物，研究了11种农药对斜纹夜蛾细胞的毒杀活性。结果表明，杀菌剂丙环唑的活性最高，处理后24h和48h，丙环唑对斜纹夜蛾细胞的LC50值分别为23．89μg／mL和13．62μg／mL。在活体试验中，以0．5μg／头剂量的丙环唑注射斜纹夜蛾4龄幼虫，处理后24h和48h，试虫血淋巴中血细胞数分别下降了19．67％、21．38％，血淋巴含量分别下降了20．42％、23．87％。以0．5μg／头和1．0μg／头剂量的丙环唑注射处理后，斜纹夜蛾幼虫体重显著降低。在注射处理后48h和72h，丙环唑对斜纹夜蛾4龄幼虫的LD50值分别为0．91μg/头和0．63μg/头。丙环唑对斜纹夜蛾细胞和斜纹夜蛾幼虫均具有较好的毒杀活性，显示出杀菌剂丙环唑衍生物控制害虫的可能性。     

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-Δsly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P<0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活。该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制。     

抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

旨在考察鼠源抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。采用兔血红细胞悬液的溶血性和小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)的细胞毒性考察CRAMP的安全性;采用不同温度、蛋白酶、金属离子和酸碱梯度对CRAMP抗菌活性的影响,考察其稳定性;通过在6孔细胞培养板中构建铜绿假单胞菌(PAO1株)成熟生物被膜,以人源抗菌肽LL-37和3种抗菌药为对照,采用结晶紫染色法检测生物被膜量,平板菌落计数法对生物被膜活菌数进行计数,苯酚-硫酸法结合Folin-酚试剂法检测生物被膜胞外基质含量,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察CRAMP干预PAO1生物被膜形态学的变化。结果显示,CRAMP在所测试浓度下对兔血红细胞溶血率均<2%;在62.5~125 mg·L^-1时对 RAW264.7没有细胞毒性。温度(25~100 ℃)、两种盐离子(Na⁺、K⁺)以及pH为5~10时对CRAMP的抗菌活性没有影响;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均不同程度影响了CRAMP的抗菌活性。6孔细胞培养板中,4倍MIC 的CRAMP极显著降低了PAO1生物被膜量(减少率为76.74%,P<0.01),极显著减少了生物被膜中的活菌数量(减少了1.2个CFU·mL^-1,P<0.01),效果优于LL-37和3种抗菌药。CRAMP组的胞外基质显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)。CLSM结果显示：与对照组相比较,4MIC浓度下,CRAMP组的细菌总荧光强度(PI+SYTO)显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05);与空白对照组相比,CRAMP组和LL-37组的死菌荧光强度/活菌荧光强度比值 (PI/SYTO)均极显著增大(P<0.01)。综上表明,CRAMP具有低溶血性、低细胞毒性,除蛋白酶作用不稳定外,具有较好的稳定性,对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用,且效果优于LL-37,具有良好的药物开发前景。     

Cytotoxicity of surfactants to the FHM-sp cell line

Cytotoxicity of eight surfactants was determined by the neutral red assay with the fathead minnow (FHM)-sp cell line, a cell line in suspension culture from fish. The toxicity ranking of the surfactants was benzalkonium chloride > benzethonium chloride > sodium linear - dodecylbenzene–sulfonate (LAS) > potassium laurate > sodium dodecylsulfate > polyoxyethylene(20)sorbitan monolaurate > polyoxyethylene(20)sorbitan monooleate > betaine. The toxicity ranking of the surfactants classified into four groups based on the ion of the hydrophilic group was cationic surfactants > anionic surfactants > non-ionic surfactants > amphipathic surfactants. The FHM-sp cells, as well as the chinook salmon embryo (CHSE)-sp cells, could be inoculated directly to the microplate wells without dispersion by trypsin treatment of cell sheets at room temperature. Therefore, the cytotoxicity assay of the surfactants could be carried out quickly by using the FHM-sp cell line. The FHM-sp cell line had similar or higher sensitivity to sodium dodecylsulfate compared with several cell lines from mammals. The cytotoxicity assay could be shortened by the procedure exposing the surfactants to the FHM-sp cells before the cell monolayer formation in the microplate wells. To use the FHM-sp cell line as a screening tool prior to in vivo testing, studies on the correlation between in vivo data and in vitro data on the toxicity of surfactants are necessary.     

Tanjungides A and B: New Antitumoral Bromoindole Derived Compounds from Diazona cf formosa. Isolation and Total Synthesis

Tanjungides A (1) (Z isomer) and B (2) (E isomer), two novel dibrominated indole enamides, have been isolated from the tunicate Diazona cf formosa. Their structures were determined by spectroscopic methods including HRMS, and extensive 1D and 2D NMR. The stereochemistry of the cyclised cystine present in both compounds was determined by Marfey’s analysis after chemical degradation and hydrolysis. We also report the first total synthesis of these compounds using methyl 1H-indole-3-carboxylate as starting material and a linear sequence of 11 chemical steps. Tanjungides A and B exhibit significant cytotoxicity against human tumor cell lines.