降解AFB1的枯草芽孢杆菌S1分离与鉴定

【目的】筛选出能够高效降解黄曲霉毒素（aflatoxin,AF）的菌株,并对其降解活性及残留毒性进行检测,以期为黄曲霉毒素B₁（alflatoxin B₁,AFB₁）污染防治提供参考。【方法】采集耗牛、绵羊等草食性动物粪便和养殖场霉变饲料,以AFB₁的结构类似物香豆素为唯一碳源筛选降解AFB₁效率最高的菌株,并对其进行形态学、生理生化和16S rDNA鉴定。取AFB₁与适量筛选菌株的发酵液混合,使AFB₁的浓度为1 μg/mL,37℃、150 r/min培养,测定培养不同时间AFB₁降解率;应用差速离心法分别制取上清液、菌悬液和菌体,将菌体超声裂解后制得胞内液,测定不同组分对AFB₁的降解率;对上清液分别进行蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理,检测处理后上清液AFB₁降解率;分别用不同浓度的饱和硫酸铵沉淀处理上清液,检测AFB₁降解率;应用7 ku透析袋对上清液进行浓缩,检测AFB₁降解率,从而判断菌株活性成分的性质和分布。将鸡肝细胞分为AFB₁组、AFB₁-菌株组、菌株组和空白对照组,用实时荧光定量PCR检测各组鸡肝细胞中白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosisi factor alpha,TNF-α）和Bcl-2-associated X蛋白（Bax）基因的相对表达量。【结果】经初筛和复筛,从编号为S₁的绵羊粪便样品中分离出1株菌株,其降解AFB₁的活性最高,降解率可达60.36%。菌株S₁在LB固体培养基上培养12 h,可观察到淡黄色不透明菌落,表面光滑,有隆起,镜检革兰氏染色呈阳性,杆状。16S rDNA基因进行PCR扩增并进一步测序分析,其序列与LC55966.1的同源性为100%。综合16 S rDNA序列分析和生理生化结果鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌发酵液与AFB₁（1 μg/mL）反应4、12、24、48和72 h,降解率分别达到10.98%、25.36%、46.24%和52.65%和80.84%。上清液AFB₁降解率显著高于菌悬液和胞内液（P<0.05）。热处理后,上清液的AFB₁降解活性降低,而经蛋白酶K和SDS处理后降解活性基本丧失。用不同浓度饱和硫酸铵处理的上清液AFB₁降解率差异不显著（P>0.05）,而经透析浓缩后的上清液AFB₁降解率显著高于硫酸铵处理的上清液沉淀蛋白（P<0.05）。在鸡胚胎肝脏原代细胞上,与AFB₁组相比,AFB₁经枯草芽孢杆菌S₁降解后诱导IL-6、TNF-α以及Bax的表达量均显著降低（P<0.05）。【结论】筛选到1株枯草芽孢杆菌S₁,其具有较高的降解AFB₁的活性,其降解活性主要来自于培养液上清中的蛋白质;AFB₁经降解后其毒素显著降低。     

泰山枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其对黄曲霉毒素B1的降解研究

本试验旨在从泰山土壤中筛选出具有降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）作用的枯草芽孢杆菌,经16S rRNA基因测序鉴定为枯草芽孢杆菌,最终确定1株具有较高降解作用的枯草芽孢杆菌,命名为泰山枯草芽孢杆菌,并利用该菌株对AFB₁进行了降解率、活性组分、性质的确定及降解饲料中AFB₁效果的研究。结果表明,泰山枯草芽孢杆菌对AFB₁的降解率达90.28%,其中,泰山枯草芽孢杆菌发酵后的上清液对AFB₁的降解活性最高,确定发酵后的上清液中存在解毒活性组分;对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后,解毒活性显著降低,表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶;应用性试验进一步证明泰山枯草芽孢杆菌能降解霉变饲料中的AFB₁,可在饲料或食品行业应用。     

布拉酵母菌对黄曲霉毒素B1脱毒特性研究

本试验研究了不同菌体预处理、不同浓度菌体、不同作用时间、不同pH环境对布拉酵母菌脱除黄曲霉毒素B₁(AFB₁)效果的影响。结果发现,布拉酵母菌脱除AFB₁的主要机理是吸附作用;与2 mol/L HCl 121 ℃处理30 min相比,100 ℃处理30 min更有利于布拉酵母菌对AFB₁的脱毒;强酸性和偏碱性的环境也利于布拉酵母菌对AFB₁的脱毒。     

黄曲霉毒素B1致病机制及防治研究进展

黄曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是一类来自于霉菌中的剧毒物质, 其中以黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁, AFB₁)的毒性最强、危害性最大。AFB₁是一种具有强致癌性及剧烈毒性的双呋喃环类毒素, 广泛分布于霉变的玉米、花生、大米和大豆等粮油作物中, 由AFB₁引发的人与动物中毒事件给当前食品安全和畜禽养殖等行业的发展造成了严重危害。AFB₁已被证明能够引起机体氧化应激、细胞凋亡、细胞焦亡、基因突变及免疫系统损伤。作者阐述了AFB₁抑制机体免疫系统、破坏机体免疫耐受性的免疫毒性作用; 介绍了AFB₁促进活性氧生成、激活Nrf2-ARE通路、诱导机体氧化应激和炎症反应进而造成器官损伤的器官毒性作用; 分析了AFB₁利用细胞死亡相关受体调控外源性细胞凋亡作用, 以及通过一系列细胞凋亡相关蛋白诱导内源性细胞凋亡作用, 还可利用肝细胞经典焦亡途径引发炎症反应, 继而引发非正常死亡的细胞毒性作用; 回顾了近年来关于AFB₁基因毒性与其去毒措施的作用机制及其研究进展。本综述有望为针对AFB₁致病机制的深入研究及相关防治药物的研发提供参考, 并为发霉粮油作物的去毒措施的选择提供有效依据。     

黄曲霉毒素B1对肉鸡毒性危害研究进展

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是目前自然界中已知致癌性最强、毒性最大的真菌毒素。AFB₁能够对肉鸡日粮造成污染，从而限制我国肉鸡养殖业的健康发展。现阶段AFB₁对肉鸡毒性危害主要体现为慢性消耗。文章综述了肉鸡的遗传、生理和环境因素对AFB₁毒性的影响以及AFB₁对肉鸡生产性能、免疫系统和组织器官的影响，并对肉鸡生产中常用解毒剂的特点进行总结，为减轻AFB₁对肉鸡的危害提供参考。     

黄曲霉毒素对肉鸡毒性作用的研究进展

黄曲霉毒素主要是由黄曲真菌和寄生曲真菌产生的一类高毒性次级真菌代谢物质,世界范围内大部分的粮食和动物饲料受到黄曲霉毒素的污染,对动物健康与畜禽养殖业可持续发展构成严重威胁。黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）是众多霉菌毒素中常见且毒性较强的一种,过量摄入AFB₁具有致癌、致畸、免疫抑制等毒性效应。大量研究证实AFB₁可对肉鸡的生长、免疫功能、器官发育等方面造成严重影响,威胁家禽业的健康发展。结合国内外研究报道,对黄曲霉毒素的性质、毒性进行概述,从肠道功能障碍、免疫抑制、器官损伤和遗传毒性四个方面阐述AFB₁对肉鸡毒性作用的研究进展,以期为进一步阐明黄曲霉毒素对肉鸡毒性作用的分子机制,同时为减轻黄曲霉毒素对肉鸡养殖造成的危害提供参考。     

富硒乳酸菌对黄曲霉毒素B1诱导鸡小肠上皮细胞凋亡的影响

试验旨在探究富硒乳酸菌对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)对鸡小肠上皮细胞(CSIEC)凋亡的影响。将体外培养的CSIEC细胞分为对照组(C)、AFB₁(300 μmol/L AFB₁)、AFB₁+0.01 Se(300 μmol/L AFB₁+0.01 μmol/L富硒乳酸菌,以Se计)、AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组,待细胞长至60%~70%汇合时,AFB₁+0.01 Se、AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组培养液更换为含对应Se浓度的培养液,对照组和AFB₁组更换为正常培养液,8 h后向含AFB₁组加入300 μmol/L AFB₁,继续培养24 h。用CCK-8法检测细胞存活率,ELISA法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,TUNEL法检测细胞凋亡率,Western blotting检测线粒体通路和内质网通路相关蛋白Bcl-2、Bax、PERK、ATF4、CHOP、GRP78、p53和p21的表达。细胞存活率检测结果表明,与对照组相比,其余各组CSIEC存活率均极显著降低(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组存活率均极显著升高(P<0.01)。LDH活性检测结果表明,与对照组相比,其余各组LDH活性均极显著升高(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组LDH活性均极显著降低(P<0.01)。细胞凋亡率检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组TUNEL阳性细胞数极显著升高(P<0.01),且与加硒各组差异均不显著(P>0.05)。Bcl-2/Bax表达量检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组Bcl-2/Bax极显著降低(P<0.01),AFB₁+0.05 Se组显著升高(P<0.05)。内质网应激通路相关蛋白表达量检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组PERK、CHOP、GRP78和p53的表达量均极显著升高(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组PERK、GRP78表达量均极显著降低(P<0.01),AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组CHOP和p53的表达量均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05)。因此,富硒乳酸菌能够缓解AFB₁诱导的CSIEC凋亡。     

绿色富硒生物猪饲料中AFB1达标生产工艺优化研究

饲料中黄曲霉毒素(AFB₁)容易超标,检出率达80%~100%,毒性大,具强致癌性,可抑制生猪免疫机能,降低动物生产性能,引起动物继发感染,还会在动物产品中残留而威胁人类健康,给生猪养殖带来经济损失,降低猪肉食品安全性。本文通过使用先进固体发酵系统设备和益生菌发酵技术,采用单因素试验和响应面中试优化,获得发酵降解猪饲料AFB₁的最佳工艺参数为硒浓度0.3 mg/kg,发酵时间12 h,量子波强度30 Hz,益生菌菌种组合CGMCC NO.17328混合CGMCC NO.15611。该工艺将猪饲料AFB₁量从63.41μg/kg降解到2.98μg/kg,降解率达到95.30%,AFB₁含量达到国家饲料安全标准。生产工艺适合养猪场低成本快速生产AFB₁达标猪饲料。     

桦褐孔菌提取物对黄曲霉素B1暴露小鼠肝损伤的缓解作用

【目的】探究桦褐孔菌提取物(IOE)对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)暴露小鼠肝损伤的保护作用及机制。【方法】选取30只6周龄、体重相近的SPF级雄性C57BL/6小鼠,随机分为5组,对照组连续灌胃蒸馏水10 d; AFB₁组第1～7天连续灌胃蒸馏水,第8～10天连续灌胃2 mg/kg AFB₁;不同浓度IOE组第1～7天分别连续灌胃25、50和100 mg/kg IOE,第8～10天各组均连续灌胃2 mg/kg AFB₁,灌胃剂量均为0.2 mL,每天1次。试验结束后对小鼠称重并采集血液、肝脏组织,统计肝脏指数;通过苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理变化;利用流式细胞仪分析肝脏细胞凋亡情况。通过细胞毒性试验,筛选AFB₁诱导AML12细胞损伤最适条件,并以此建立肝损伤模型,给予不同浓度IOE进行干预,利用CCK-8法测定细胞活力,确定IOE防治AFB₁诱导AML12细胞损伤的剂量范围。使用ELISA法检测血清和细胞中炎性因子白细胞介...     

AFB1降解剂对肉鸡生长性能、养分代谢及AFB1在体内残留的影响

通过在含有黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）的肉鸡日粮中添加AFB₁降解剂,测定其对肉鸡生长性能、养分代谢及AFB₁在血液、肝脏及肌肉中残留的影响。试验选择42日龄健康AA肉鸡75只随机分为5组,每组设5个重复。A组为对照组,饲喂基础日粮,B、C、D和E组在基础日粮中分别添加400、200、400和800 μg/kg AFB₁。B组为负对照组,C、D和E组分别添加0.15% AFB₁降解剂,试验期为30 d。试验结束时,测定肉鸡的生长性能、营养物质代谢率、体内AFB₁含量及抗氧化酶活性。结果表明：与AFB₁含量相同的B组相比,D组的平均日采食量和末重分别提高了32.45%、42.46%（P < 0.05）;与B组相比,其余各组的有机物、粗蛋白质、钙和磷的代谢率均有显著提高（P < 0.05）,D组的有机物和粗蛋白质消化率分别提高了9.50%和178.75%（P < 0.05）。血液、组织中AFB₁的测定结果表明,停喂AFB₁前,C组肝脏中AFB₁含量显著低于B组（P < 0.05）,停喂AFB₁24 h后,A和C组胸肌中AFB₁含量显著低于B、D和E组（P < 0.05）,停喂AFB₁48 h后,C、D组胸肌中AFB₁含量恢复到与对照组相同的水平。与B组相比,添加0.15% AFB₁降解剂的C、D和E组,血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力显著提高（P < 0.05）。由此可见,在含有AFB₁的日粮中添加AFB₁降解剂,可缓解AFB₁对生长的抑制,提高养分消化率,加速AFB₁在肉鸡体内的代谢,减少AFB₁对机体的损伤。     

黄曲霉毒素B_1与M_1对小鼠肠道细菌多样性的影响

试验旨在研究黄曲霉毒素B_1与M_1(AFB_1与AFM_1)对小鼠肠道细菌多样性的影响。选取体况良好的4周龄ICR(CD-1)雄性小鼠40只,随机分成4组,每组10个重复,每个重复1只小鼠,其中AFB_1组小鼠每只每天灌胃0.3mg/kg体重AFB_1,AFM_1组小鼠每只每天灌胃3.0mg/kg体重AFM_1,AFB_1+AFM_1组每只每天灌胃AFB_1与AFM_1的混合溶液,其中AFB_1终浓度0.3mg/kg体重,AFM_1终浓度3.0mg/kg体重,以上3组毒素溶剂均为1.0%二甲基亚砜水溶液。对照组小鼠每只每天灌胃1.0%二甲基亚砜水溶液。每只灌胃剂量均为200μL,每天09∶00灌胃一次,连续灌胃28d。灌胃结束后,处死并解剖小鼠,收集结肠内容物,采用16SrRNA测序的方法对肠内容物细菌多样性进行测序分析。结果显示:在细菌群落的门水平、科水平及属水平,与对照组相比,3个毒素处理组小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化(P>0.05),但不同的毒素处理仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化:与对照组相比,AFB_1组及联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia、Staphylococcus、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(P<0.05);而AFM_1组与对照组相比未见显著差异(P>0.05)。综合试验结果,AFB_1单独作用或与AFM_1联合作用可诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌细菌增殖,改变肠道健康微生物区系,损伤肠道微生物屏障功能。     

吖啶酯偶联单克隆抗体建立化学发光法检测黄曲霉毒素B1

[目的] 建立快速检测黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）的方法。[方法] 将吖啶酯（acridinium ester,AE）与AFB₁单克隆抗体进行体外化学合成,分别合成了吖啶酯∶AFB₁单克隆抗体摩尔比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的吖啶酯标记AFB₁单克隆抗体（AFB₁-AE）,分析了不同摩尔比的检测效果,选择吖啶酯∶AFB₁单克隆抗体为25∶1的AFB₁-AE偶联物建立化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）。[结果] 获得对应的标准曲线回归方程为：y=-0.245Ln（x）+ 1.578 1,R²=0.985 7,IC₅₀=81.48 pg/mL;对样品进行加标回收实验,加标回收率88.4%~106.0%,变异系数0.92%~2.10%。[结论] 将吖啶酯与AFB₁单克隆抗体体外交联,可建立新的化学发光免疫分析方法。     

不同氨化处理黄曲霉毒素B_1脱毒效果及其对奶牛瘤胃体外发酵的影响

试验旨在研究不同氨化处理对黄曲霉毒素B_1(AFB_1)的脱毒效果及其对奶牛瘤胃体外发酵的影响。本研究分为两个试验。试验一:对人工感染2 550μg/kg AFB_1的玉米和大米混合物(1∶3)进行氨化处理,分为对照组(Ⅰ组,未处理)和试验组Ⅱ(0.1Mpa,1h)、Ⅲ(0.1 Mpa,2h)、Ⅳ(0.1 Mpa,3h)、Ⅴ(0.2 Mpa,1h)、Ⅵ(0.2 Mpa,2h)、Ⅶ(0.2Mpa,3h)、Ⅷ(0.3Mpa,1h)、Ⅸ(0.3Mpa,2h)、Ⅹ(0.3Mpa,3h)组,每组3个重复,测定不同氨化处理的AFB_1的脱毒效果及混合物的营养成分。试验二:研究氨化处理AFB_1对奶牛体外发酵指标的影响。试验设对照组(Ⅰ组,未处理)和试验组Ⅱ(0.3Mpa,1h)、Ⅲ(0.3Mpa,2h)、Ⅳ(0.3Mpa,3h)组,每组3个重复,测定体外发酵2、4、8、12、24和48h的产气量、发酵液pH、体外干物质降解率(IVDMD)、氨态氮(NH3-N)和挥发性脂肪酸(VFA)。结果显示:在试验一中,试验组粗蛋白质(CP)含量均显著高于对照组(P<0.05);Ⅹ组(0.3 Mpa,3h)AFB_1含量显著低于其他组(除Ⅶ组外)(P<0.05)。在试验二中,Ⅳ组(0.3 Mpa,3h)发酵液pH显著低于对照组(P<0.05),体外发酵产气量、挥发性脂肪酸、氨态氮含量和体外干物质降解率(除48h外)均显著高于对照组(P<0.05),而Ⅱ(0.3Mpa,1h)和Ⅲ组(0.3Mpa,2h)组效果不明显。综上所述,氨化处理能够显著降低样品中AFB_1含量,提高CP含量,改善瘤胃发酵,其中0.3Mpa、3h处理效果最佳。     

降解黄曲霉毒素枯草芽孢杆菌的解毒性、抗菌性及抗逆性研究

试验对筛选得到的高效降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的枯草芽孢杆菌(霉立解060菌)进行解毒活性、抗菌活性及抗逆性研究。将枯草芽孢杆菌发酵液分成上清液、菌悬液和胞内液组分,验证各组分对黄曲霉毒素的解毒效率。试验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵后的上清液对AFB1、AFG1和AFM1的降解活性最高,确定发酵后的上清液中存在解毒活性组分;对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后,解毒活性显著降低,表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶;试验进一步证明枯草芽孢杆菌具有显著抑制大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌,抵抗胃酸、胆盐、高温等不利环境的特性,具有很强的抗菌性和抗逆性。     

蒙脱石和凹凸棒石对霉菌毒素吸附性能的研究

试验将蒙脱石和凹凸棒石分别添加到含有黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的人工胃液或人工肠液中,探讨2种矿物对霉菌毒素的吸附作用。结果表明,蒙脱石和凹凸棒石对AFB₁、玉米赤霉烯酮、T-2毒素的吸附均在1 h达到平衡;钠基蒙脱石对AFB₁和T-2毒素的吸附率高于钙基蒙脱石和凹凸棒石,吸附率分别为96.8%、38%;蒙脱石和凹凸棒石对玉米赤霉烯酮的吸附率均小于10%。pH对蒙脱石和凹凸棒石吸附霉菌毒素影响显著(P<0.05),pH 5时钙基蒙脱石对AFB₁的吸附率显著高于pH 3、pH 7时(P<0.05),为90.1%;蒙脱石和凹凸棒石对玉米赤霉烯酮的吸附效果在pH 3时较佳,对T-2毒素的吸附效果在pH 7时显著高于pH 3、pH 5时(P<0.05)。蒙脱石和凹凸棒石对吸附的霉菌毒素均存在解吸现象,其中AFB₁和玉米赤霉烯酮解吸明显。蒙脱石和凹凸棒石对霉菌毒素的吸附作用使其成为重要的吸附剂,然而作为吸附剂的同时不能忽视霉菌毒素的解吸现象,综合考虑吸附与解吸2种现象以便在生产实践中更好的脱除霉菌毒素。