EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrosis virus,EoNPV)是一种重要的病原微生物,为进一步明确该病毒对茶尺蠖两近缘种的毒力差异,采用叶盘法对3龄茶尺蠖和灰茶尺蠖幼虫进行了EoNPV的毒力测定。研究显示,EoNPV对灰茶尺蠖的半致死剂量LD₅₀(median lethal dose)为茶尺蠖的28.9倍,EoNPV对灰茶尺蠖的致死中时间LT₅₀(median lethal time)大于茶尺蠖。结果表明,EoNPV对茶尺蠖两近缘种间的毒力存在差异,EoNPV对茶尺蠖具有更高的致病力,研究结果对EoNPV田间防治茶尺蠖两近缘种具有现实指导意义。     

两个EoNPV毒株对茶尺蠖和灰茶尺蠖的毒力差异

通过确定不同茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EoNPV）毒株对茶尺蠖（Ectropis obliqua）和灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）毒力水平的差异,为有效提高茶尺蠖病毒的防效提供理论基础。采用浸渍法,测定EoNPV浙江毒株（EoNPV-ZJ）和江西毒株（EoNPV-JX）对茶尺蠖和灰茶尺蠖3龄幼虫的毒力水平;通过克隆测序,多重比较分析EoNPV-ZJ和EoNPV-JX毒株同源重复区（hrs）。结果表明,EoNPV-JX对灰茶尺蠖和茶尺蠖3龄幼虫14 d的LC₅₀分别为5.95×10⁶ PIB·mL^-1和3.14×10⁶ PIB·mL^-1,EoNPV-ZJ对灰茶尺蠖和茶尺蠖3龄幼虫14 d的LC₅₀分别为1.13×10⁷ PIB·mL^-1和5.04×10⁶ PIB·mL^-1。EoNPV-JX和EoNPV-ZJ的hr1大小均为1 795 bp,含有11个完全回文序列,hr3大小均为665 bp,含有3个完全回文序列,与已报道的安徽毒株（EoNPV-AH）无差异;而hr2差异较大,其中EoNPV-JX hr2为864 bp,含有7个完全回文序列,EoNPV-ZJ hr2为1 168 bp,含有12个完全回文序列,均少于EoNPV-AH的18个完全回文序列。综合分析显示,EoNPV不同毒株对茶尺蠖的毒力水平高于其近缘种灰茶尺蠖;EoNPV-JX毒株对灰茶尺蠖的毒力高于EoNPV-ZJ毒株,造成EoNPV不同毒株毒力差异的主要原因可能与其hr2序列回文序列个数相关。     

茶尺蠖病毒研究进展

茶尺蠖是茶树上一种重要的食叶性害虫,分布于我国各茶区,经常在局部茶园暴发成灾,对茶叶生产造成严重的损失。茶尺蠖病毒是控制茶尺蠖自然种群消长的重要因子,主要包括茶尺蠖核型多角体病毒和茶尺蠖小RNA病毒。本文综述了茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）生物学特性、扩繁、制剂的研发与应用、定性定量检测技术的建立、重组NPV病毒和茶尺蠖小RNA病毒分子生物学方面的研究进展情况,为更好的利用病毒防治茶尺蠖提供参考。     

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。     

不同地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性差异研究

采集来自浙江、湖南、湖北和江苏省的7个不同地理种群茶尺蠖,用茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）进行室内生物测定,结果表明不同地理种群茶尺蠖对EoNPV敏感性存在明显差异。浙江杭州种群和江苏宜兴种群对EoNPV的敏感性较高,饲毒后11d幼虫全部死亡,致死中浓度（LC₅₀）分别为8.32×10⁴PIB/mL和8.61×10⁴PIB/mL;其他5个地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性较低,饲毒后11d的死亡率均在30%以下,致死中浓度LC₅₀在1.35×10⁷~6.03×10⁷PIB/mL之间;其中敏感性最低的浙江衢州种群和敏感性最高的江苏宜兴种群毒力差异达724.5倍。     

茶尺蠖核型多角体病毒制剂的研制

茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）是茶尺蠖的主要病原微生物。试验研制了3种EoNPV制剂，分别是EoNPV乳剂、EoNPV-Bt乳剂、EoNPV-溴氰可湿性粉剂。3种制剂在室内和田间对茶尺蠖的防治效果均在90％以上。茶园示范应用1万hm^2，经济效益和生态效益明显。并对3种制剂的田间使用技术进行了研究和讨论。     

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

两近缘种茶尺蠖的抗菌肽基因在抵抗EoNPV感染过程中的表达差异

小茶尺蠖Ectropis obliqua Prout和灰茶尺蛾Ectropis grisescens Warren是危害茶园的两近缘种害虫。用小茶尺蠖核型多角体病毒E.obliqua nucleopolyhedrovirus(Eo NPV)喂饲两近缘种茶尺蠖,10 d后小茶尺蠖的死亡率为100%,而灰茶尺蛾的死亡率仅为35.5%。以感染病毒的两近缘种3龄幼虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得了gloverin、attacin和moricin 3个抗菌肽基因,通过邻位连接法构建系统发育树聚类分析显示小茶尺蠖和灰茶尺蛾的Gloverin、Attacin和Moricin蛋白均分别归为一个分支;进一步采用qPCR检测发现,病毒处理后gloverin、attacin和moricin 3个基因在两近缘种茶尺蠖体内均表达上调,gloverin基因在12 h达到最大值,moricin基因在48 h达到最大值,且gloverin和moricin基因在灰茶尺蛾中表达量显著高于小茶尺蠖,而attacin基因在病毒侵入后的不同时期在两近缘种茶尺蠖体内表达量是变化的,推测gloverin、moricin和attacin基因可能与病毒的侵入有关。这一研究结果为进一步揭示抗菌肽基因在昆虫与病毒互作中的作用打下了基础。     

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1.1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒.为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPV gp41基因的部分序列.序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低.     

温度对茶尺蠖核型多角体病毒形态发生的影响

电镜观察结果表明,26℃下茶尺蠖核型多角体病毒形态发生正常,其过程可分成病毒发生基质的形成—核衣壳的形成—病毒粒子的形成—多角体成熟四个阶段,一个细胞核切面可见1～50,甚至更多的多角体,30℃下则其形态发生受阻,开始饲毒后168小时内,宿主中肠上皮细胞和脂肪体细胞核中均未见病毒有关结构,仅观察到染色质凝集块,这应是高温季节该病毒防治效果差的重要原因之一。 此外,在26℃下饲毒所得宿主细胞切片中,还观察到了核内的大量管状物,特长病毒粒子及内含纤维物的具双层膜的囊状物,核内和细胞质中具侧膜的成束纤维状物等特殊结构。