茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

两性生命表研究灰茶尺蠖与茶尺蠖生长发育和繁殖力

灰茶尺蠖[Ectropis grisescens (Warren)]与茶尺蠖[Ectropis obliqua (Prout)]为茶园两种重要的食叶性害虫,严重影响茶叶的产量和品质。利用年龄-阶段两性生命表,在室内测定两种尺蠖的生长发育指标及年龄-阶段特征存活率、雌成虫年龄-阶段特征繁殖力、年龄-阶段特征寿命期望值、年龄-阶段特征繁殖值和种群参数,并分析各参数的差异。结果表明,灰茶尺蠖的1、2、4、5龄幼虫发育历期、幼虫总历期、蛹期及成虫寿命（分别为3.22、2.55、1.43、4.56、15.34、7.98、7.59 d）均显著低于茶尺蠖（分别为4.07、3.05、2.16、5.71、18.83、8.88、10.65 d）;灰茶尺蠖2~5龄幼虫存活率（分别为100.00%、95.00%、62.00%和96.00%）均高于茶尺蠖（分别为93.00%、71.00%、45.00%和80.00%）;灰茶尺蠖平均世代周期（32.412 d）显著短于茶尺蠖（36.016 d）。灰茶尺蠖年龄-阶段特征存活率、内禀增长率比茶尺蠖高,平均世代周期（T）比茶尺蠖短,其种群能更迅速扩增。研究结果为灰茶尺蠖和茶尺蠖室内种群饲养提供基础数据,为两近缘种的竞争机制及种群控制策略选择提供理论依据。     

茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为10³~10⁸拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。     

不同地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性差异研究

采集来自浙江、湖南、湖北和江苏省的7个不同地理种群茶尺蠖,用茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）进行室内生物测定,结果表明不同地理种群茶尺蠖对EoNPV敏感性存在明显差异。浙江杭州种群和江苏宜兴种群对EoNPV的敏感性较高,饲毒后11d幼虫全部死亡,致死中浓度（LC₅₀）分别为8.32×10⁴PIB/mL和8.61×10⁴PIB/mL;其他5个地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性较低,饲毒后11d的死亡率均在30%以下,致死中浓度LC₅₀在1.35×10⁷~6.03×10⁷PIB/mL之间;其中敏感性最低的浙江衢州种群和敏感性最高的江苏宜兴种群毒力差异达724.5倍。     

一株茶大灰象甲寄生真菌的分子鉴定及其毒力测定

为明确分离自茶大灰象甲（Sympiezomias citri）自然羅病死亡成虫僵虫的一株寄生真菌Bbr4941菌株的具体分类归属及其生防潜力,对该菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列进行了PCR扩增、测序及系统进化树构建。结果明确了它为布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）。在此基础上,利用浸虫法研究该菌株对茶大灰象甲成虫的室内毒力。结果表明,高浓度（每毫升5.0×10⁷孢子）孢悬液处理时,第7天累计校正死亡率为100%,LT₅₀为3.916βd。以上研究表明Bbr4941菌株对茶大灰象甲成虫具有很强的杀虫毒力,有望在今后茶大灰象甲的生物防治中发挥重要作用。     

条纹蝇虎对灰茶尺蠖幼虫的捕食作用

为明确条纹蝇虎（Plexippus setipes）对灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）的防控效果,在室内条件下,开展了条纹蝇虎对灰茶尺蠖幼虫的捕食量、捕食功能反应、捕食选择性和种内干扰效应的研究。结果显示,条纹蝇虎偏好捕食灰茶尺蠖低龄幼虫,不同发育阶段捕食能力存在显著差异;其中成蛛捕食能力最强,日均可捕食灰茶尺蠖1龄幼虫17.44头,幼蛛捕食能力相对较弱,日均捕食1龄幼虫2.33头。条纹蝇虎捕食功能反应符合Holling Ⅱ模型,捕食量随灰茶尺蠖幼虫密度的增加而增加,而搜寻效应逐渐降低。捕食选择性试验表明,条纹蝇虎对灰茶尺蠖1龄幼虫和2龄幼虫表现为正喜好性（Ci>0）,对3龄幼虫表现为负喜好性（Ci<0）。条纹蝇虎对灰茶尺蠖幼虫的捕食作用同时受自身密度的影响,存在较强的种内干扰反应,该反应符合Hasse Ⅱ模型。研究表明,条纹蝇虎对灰茶尺蠖幼虫具有较强的捕食能力和良好的防控潜能,这为利用茶园蜘蛛天敌资源提供理论依据。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白EoblGOBP2与茶树挥发物的结合功能研究

茶尺蠖是茶园中一种重要的鳞翅目害虫,主要以幼虫取食危害茶树叶片,给茶叶生产带来了严重威胁。茶尺蠖在寻找配偶、产卵地以及觅食活动中其嗅觉系统发挥了非常重要的作用。本研究以茶尺蠖Ectropis obliqua Prout嗅觉系统中的一个普通气味结合蛋白——EoblGOBP2为研究对象,在克隆得到的EoblGOBP2基因基础上,通过对EoblGOBP2进行原核表达、分离纯化后,利用1-NPN的荧光竞争结合法研究了体外重组EoblGOBP2与茶树挥发物的结合生理功能。Scatchard方程显示EoblGOBP2与1-NPN的解离常数K_D为2.310 μmol·L^-1。在荧光竞争结合实验中,7种待测配基均能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,表明与EoblGOBP2均有较强的结合能力,而其中邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,K_D值达到4.353 μmol·L^-1。本研究7种配基均为茶树叶片挥发物,表明EoblGOBP2在茶尺蠖嗅觉系统对茶树挥发物的信息识别结合功能中发挥了重要作用。     

茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12βh显著诱导了CsANR基因的相对表达水平,且在为害后3βh和12βh达到了极显著差异。CsLAR基因在茶尺蠖为害后6βh和12βh,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24βh显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48βh仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24βh和48βh均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。     

茶树对茶尺蠖抗性机制研究

茶尺蠖[Ectropis oblique (Prout)]危害严重降低了茶叶产量和品质。业已表明,不同茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]品种对茶尺蠖取食的胁迫反应复杂多样,探究茶树对茶尺蠖的抗性机制,对于鉴定茶树抗虫性等级,发掘利用抗虫基因资源以及培育抗虫良种具有重要意义。本文从简述茶尺蠖危害概况入手,总结了当前茶树对茶尺蠖抗性机制研究的新成果,指出了目前茶尺蠖抗性机制研究中存在的问题,并分析了当前的研究动向与前景。     

一株对茶丽纹象甲高毒力白僵菌菌株的筛选、鉴定与培养研究

茶丽纹象甲（Myllocerinus aurolineatus）是一种重要的茶树害虫,当前对其防治仍以化学手段为主。为寻找一种高效、安全和可持续的生物防治方法,本研究采用浸虫法从12株原寄主为鞘翅目昆虫的白僵菌Beauveria spp.中筛选出一株对茶丽纹象甲成虫高毒力的Bbr1552菌株。室内生物测定结果表明,用每毫升含5.0×10⁷个孢子的孢悬液（25℃）处理茶丽纹象甲成虫的LT₅₀值为4.49 d,处理7 d,茶丽纹象甲的累计校正死亡率为100%,僵虫率为69.44%,LC₅₀值为每毫升1.55×10⁶个孢子。对菌株Bbr1552进行形态学鉴定与rDNA-ITS序列和Bloc序列分析,明确其为布氏白僵菌Beauveria brongniartii。此外,对该菌株的最适培养基和培养温度研究发现,其最适生长和产孢培养基均为PPDA培养基;最适生长和产孢温度均为25℃。     

化学感受蛋白直系同源基因CSP8在茶尺蠖及近缘种灰茶尺蠖中的表达分析

化学感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学通讯及其他生理过程中发挥重要功能.茶尺蠖与其近缘种灰茶尺蠖是茶园重要鳞翅目害虫,对我国茶叶的安全生产造成严重危害.研究化学感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖两近缘种间的表达,有助于研发同时针对该两种害虫的绿色防控技术.通过荧光定量qRT-PCR分析...     

14种植物精油对茶尺蠖行为的影响

为获得能够应用于茶园茶尺蠖Ectropis obliqua“推—拉”策略的行为调节剂,在室内测定了茶尺蠖成虫对14种植物精油的趋性反应,及植物精油对茶尺蠖雌虫产卵行为的干扰作用,并采用叶碟法测定了植物精油对茶尺蠖幼虫的拒食作用。结果表明,罗勒、迷迭香、肉桂、茴香及天竺葵5种植物精油对茶尺蠖成虫表现出一定的驱避活性,并且迷迭香油和天竺葵油还能显著干扰雌虫的产卵活动。在3个浓度处理下,茴香、罗勒和藿香植物精油对茶尺蠖3龄幼虫表现出显著的拒食活性。随着精油处理浓度的升高,茶尺蠖幼虫的拒食率升高,生长率随之下降。试验结果证明迷迭香、罗勒、茴香及天竺葵等植物精油对茶尺蠖具有显著的行为调控功能,具备作为茶尺蠖防控剂开发的潜力,值得进一步研究。     

茶尺蠖丝氨酸蛋白酶基因EoSP1的克隆、时空表达及对饥饿的表达响应

丝氨酸蛋白酶是鳞翅目昆虫消化系统中一类重要的蛋白酶。本研究从茶尺蠖（Ectropis obliqua）中克隆到一条丝氨酸蛋白酶基因EoSP1并分析了其结构特征和表达特性。EoSP1基因序列全长858 bp,编码285个氨基酸,预测蛋白分子量为29.53 kDa,等电点为5.44。经与其他丝氨酸蛋白酶比对,EoSP1含有保守的丝氨酸蛋白酶催化位点（H₉₅,A₁₆₁和S₃₂₈）及蛋白互作结构域,与蓓带夜蛾（Mamestra configurata）中SPs亲缘关系较近。进一步获得了与EoSP1-GST融合蛋白大小接近的目的蛋白。qRT-PCR分析发现,EoSP1在幼虫期的表达显著高于成虫、蛹和卵期,并在幼虫中肠中特异性表达;饥饿处理后EoSP1表达下降,恢复饲喂后表达量接近对照组。以上结果为茶尺蠖消化酶功能解析及抗虫新靶点的筛选提供了依据。     

光谱对灰茶尺蠖成虫光反应行为的影响

为获得灰茶尺蠖（Ectropis grisescens Warren）的趋光/避光反应特征、光谱反应范围及性别差异,采用光行为学的方法研究了370~600 nm范围内的18种不同波长的单色光对成虫趋光、避光反应行为的影响。结果显示,各单色光均能引起灰茶尺蠖成虫一定的趋光或避光反应,雌虫在橙光（600~605 nm）、绿光（520~525 nm）、紫光（370~375 nm）范围内趋光性明显;雄虫在绿光（520~525 nm）、紫光（395~400 nm和390~395 nm）范围内趋光性明显;雌虫在冰蓝青光（490~495 nm）、蓝光（440~450 nm）和红光（660~665 nm）范围内避光性明显;雄虫在紫光（400~405 nm）、蓝光（440~450 nm）、冰蓝青光（490~495 nm）和自然白光（CK）范围内避光率较高。研究表明,灰茶尺蠖成虫对不同波长光的趋、避性存在差异,性别对其光谱行为反应有一定的影响。     

基于CLIMEX和ArcGIS的灰茶尺蠖在中国的潜在适生区预测

基于中国820个气象站点数据、灰茶尺蠖已知地理分布资料和生物学数据,结合CLIMEX模型与ArcGIS软件模拟预测灰茶尺蠖在中国目前及未来的潜在分布范围,评估灰茶尺蠖的潜在分布范围及气候变暖对其分布的潜在影响。结果表明,灰茶尺蠖在中国目前的适生区主要分布在3°51′N~40°6′N,适生区面积占全国总面积的34.27%。中国大部分省份的气候条件均适合灰茶尺蠖种群生长。随着气候的变化,灰茶尺蠖在中国的潜在适生区面积总体增幅不大,但其组成变化较大。至2050年,预测灰茶尺蠖高度适生区面积占比达最大（22.23%）。相比各种能源之间的平衡情景（A1B）,较高能源需求情景（A2）下灰茶尺蠖在陕甘宁地区向内陆扩张更快。灰茶尺蠖在中国适生区分布广泛,应加强灰茶尺蠖预测预报,趁早采取防控措施,以保障茶叶优质安全生产。     

冠突散囊菌和植物乳杆菌联合发酵对绿茶液态饮料品质的影响

为了抑制冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料中儿茶素的降解,本研究采用植物乳杆菌和冠突散囊菌对绿茶液态饮料进行联合发酵,试验通过响应面法优化了联合发酵绿茶液态饮料工艺,并采用高效液相色谱（HPLC）法和顶空固相微萃取串联气质联用（HS-SPME/GS-MS）法分别检测了联合发酵绿茶液态饮料中儿茶素含量和香气成分。结果表明,在干茶添加量10βg·L^-1、冠突散囊菌添加量10βmL·L^-1的前提下,联合发酵绿茶液态饮料的最佳工艺条件为植物乳杆菌添加量20βmL·L^-1、蔗糖添加量75βg·L^-1、30℃下静置发酵3βd。在此工艺下联合发酵绿茶液态饮料中总儿茶素含量为1β419.94βμg·mL^-1,与冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料（848.72βμg·mL^-1）相比,显著增加（P<0.05）;且醇类化合物（30.27%）、醛类化合物（15.25%）、烃类化合物（11.35%）、酯类化合物（9.86%）和酮类化合物（9.01%）含量与未发酵绿茶液态饮料相比均显著增加（P<0.05）。     

灰茶尺蠖雌成虫生殖器形态特征与组织结构的研究

为了解茶树主要食叶类害虫灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)雌成虫的内外生殖器结构特征,通过解剖切片和显微观察的方法,明确了雌成虫内外生殖器主要由1对卵巢、1对侧输卵管、1根中输卵管、1个受精囊、附腺、产卵孔、交配囊及其附属结构、导精管、表皮突和肛突等组成。卵巢小管8根,左右对称;交配囊呈典型袋状结构,内有表面布满刺状突的心型交尾囊片,且囊片左右两侧16根刺状突呈对称分布;后表皮突较细长,似铲状。切片观察可知,卵巢管滋养细胞和卵母细胞交替排列,为典型的多滋式;产卵器内有发达的性腺等。掌握灰茶尺蠖雌成虫生殖器结构,对其卵巢发育级别划分、田间预测预报、近缘种的鉴定以及性信息素的研究等具有重要意义。