伊氏锥虫多种克隆群体的采集及血清学检测

针对伊氏锥虫抗原变异，国内外学者对抗原变异规律进行了研究，对其抗原变异程序、变异数量、变异频率等有了一定的了解，在此基础上进行免疫学研究进而寻求防治锥虫病的免疫学手段。但多局限于某种动物个体感染锥虫后的一小段有限的时间进行，所获得的抗原变异型数量较少，因而很难澄清如：一个虫株究竟能有多少变异机会，是以怎样的程序变异的等问题。     

伊氏锥虫弱毒株免疫家兔的T细胞应答反应

以ANAE染色法和~3H-TdR掺入的淋巴细胞转化试验,测定了伊氏锥虫弱毒株免疫家兔的T细胞动态变化.结果,免疫兔外周血T细胞增殖反应在免疫后第24d达到高峰,ANAE阳性细胞百分率这72.65%,对照组仅为41.2%;约1周后,出现抑制性T细胞,其增殖反应也明显减弱,最后完全被抑制.而外源性白细胞介素2的加入,可解除这种免疫抑制.攻虫后,特异性T细胞应答反应未再出现强烈的回忆反应,但伊氏锥虫弱毒株免疫家兔获得9/12的保护.因此,T细胞在这种抗锥虫免疫中,没有起到主导作用.     

伊氏锥虫安锥赛抗药性相关基因-TbTA1的分析

为探讨伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子机理，以布氏锥虫对砷剂药物抗药性相关的TbTA1基因设计引物，以55℃、57℃、60℃、63℃和65℃不同退火温度，分别从伊氏锥虫敏感株的cDNA和基因组DNA中扩增出TbTA1基因的全长序列，但是从安锥赛抗药株伊氏锥虫的cDNA和基因组DNA中都未扩增出TbTA1基因，这表明基因TbTA1可能与伊氏锥虫安锥赛抗药性的产生有关。伊氏锥虫与布氏锥虫的，TbTA1基因序列比较，它们有10个碱基不同，即第88位的G（T.e）-A（T.b）、第144位的T（T．e）-C（T．b）、第224位的C（T．e）-T（T．b）、第471位的C（T.e）-T（T.b）、第472位的A（T．e）-G（T.b）、第549位的G（T．e）-T（T．b）、第1008位的C（T．e）-T（T.b）、第1033位的A（T．e）-G（T．b）、第1293位的A（T．e）-G（T．b）和第1384位的T（T．e）-C（T．b），其中有5个碱基所编码的氨基酸不同，即Val^30（T.e）Ile（T．b）、Ala^75（T．e）-Val（T．b）、Ile^158（T．e）-Val（T．b）、Thr^345（T．e）-Ala（T．b）和Ser^462（T.e）-Pro（T．b），这表明伊氏锥虫与布氏锥虫的TbTA1差异可能是它们的种间差异。     

奶牛附红细胞体和伊氏锥虫二重PCR诊断方法的建立

为建立奶牛附红细胞体和伊氏锥虫两种病原诊断方法并探索二者之间在奶牛感染中的关系,本研究针对两病原分别设计两对特异性引物,建立了奶牛附红细胞体和伊氏锥虫感染的二重PCR诊断方法,其扩增片段大小分别为415bp和237bp。敏感性试验和特异性试验表明,附红细胞体和伊氏锥虫的DNA的最低检测量为0.154pg和0.105pg;与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应。35份临床血样检测结果为:奶牛附红细胞体阳性率22.89%,伊氏锥虫阳性率8.89%,其中共感染率为2.89%。临床试验表明,该方法可用于奶牛附红细胞体和伊氏锥虫的诊断,特别适用于早期诊断。     

不同浓度甘油和pH对DEAE-纤维素柱分离伊氏锥虫效果的影响

在不同ｐＨ条件下以不同浓度甘油破坏鼠红细胞后,用ＤＥＡＥ－５２纤维素柱层析分离纯化伊氏锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｅｖａｎｓｉ）,结果表明在ｐＨ７．４时,２０％甘油能溶解大约９５％的大、小鼠红细胞;经此处理后,对Ｔ．ｅｖａｎｓｉ的回收率和活力无不良影响,可明显提高其分离纯化效果。作者还观察了渗透压和ｐＨ条件改变对Ｔ．ｅｖａｎｓｉ的影响。     

伊氏锥虫谷胱甘酰亚精胺还原酶（TR）的研究（二）

用ＣＥＡＥ ＤＥ－５２分离纯化的锥虫，经超声波粉碎后离心，上清经硫酸铵沉淀，再经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００分子筛层析，ＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＥＤ－５２离子交换层析，２’，‘ＡＤＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析得到纯化。筛选到抗蠕虫药奥芬哒唑（Ｏｘｆｅｎｄａｚｏｌｅ）对ＴＲ有抑制作用。但对治疗锥虫病没有作用；兔抗ＴＲ抗体与安锥赛共同注射人工感染锥虫病的小白鼠，可增加安锥赛对锥虫病的疗效。     

伊氏锥虫在小鼠体内抗原变异规律及免疫保护试验

为了探索伊氏锥虫抗原的变异规律及其用于免疫预防的可能性，首先对伊氏锥虫安微株单虫克隆2个早期变异体ShTatl.1、ShTat1.2采用蛋白酶抑制剂TLCK处理，分离纯化这2种变异体的VSG，用ShTat1.1 VSG免疫KM小鼠，ShTat1.1锥虫攻击免疫鼠后6d分离锥虫，经间接免疫荧光试验（IFT）和班点酶标记试验（Dot-EIA)鉴定为ShTat1.2，说明同一克隆锥虫感染兔，小鼠第1次发生抗原变异后产生的变异体相同。依据这一规律，设计了免疫预防保护试验，试验小鼠分3组：一组为未免疫对照组，一组为ShTat1.1VSG单一抗原免疫组，另一组为ShTat1.1 VSG,ShTat1.2 VSG混合免疫抗原免疫组，各组均以ShTat1.1锥虫攻击，结果ShTat1.1 VSG ShTat1.2VSG免疫组小鼠全部获得保护，单用ShTat1.1 VSG免疫组小鼠和未免疫小鼠血中全部出虫、死亡，前者比后者出虫时间、存活时间延长。提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种复合抗原，能激发宿主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

锥—46抑制[^3H]次黄嘌呤掺入伊氏锥虫核酸的研究

用液体闪烁计数法对锥—46的抗锥虫作用的机理做了初步研究。发现T-46与Berenil很相似,均可显著抑制[~3H]次黄嘌呤掺入伊氏锥虫,抑制作用与浓度及时间呈正相关。T-46和Berenil对DNA合成的IC_(60)分别为1.33和1.73μg·ml~(-1)。本实验还提示T-46抗锥虫作用可能与损伤DNA模板有关。     

伊氏锥虫多因素致弱苗免疫机理的研究——补体在体液免疫和细胞免疫中的作用实验

用我室研制的伊氏锥虫多因素致弱苗免疫马血清中的补体，观察其灭活前后对体液免疫和细胞免疫的作用。结果：灭活补体的免疫血清，在体外试验，对锥虫形态活力不认异常；巨噬细胞对用灭活补体的免疫血清处理的锥虫吞噬率仅达８％；在体内试验，锥虫对小白鼠具有致病力，潜伏期为３～５ｄ，存活期为８～１６ｄ。未灭活补体的免疫血清，可使锥虫形态异常，活力减退、停止；用未被灭活补体的免疫马血清处理的锥虫，注射小白鼠可健活６０～７０ｄ，巨噬细胞对未用灭活补体的免疫马血清处理的锥虫吞噬率高达９１％。生物试验表明：被吞噬的锥虫均无感染力。从而看出补体在本虫苗的体液免疫和细胞免疫方面具有极为重要的意义。     

低温状态下伊氏锥虫的放射性核素标记及测定

为了明确伊氏锥虫在低温状态下是否仍有代谢活动，在-20℃和-80℃条件下，在伊氏锥虫保存液中添加3H-TdR活锥虫样品和未添加3H-TdR活锥虫样品，用液闪计数器测定保存的锥虫体内CPM值。结果，添加3H-TdR的活锥虫样品与未添加3H-TdR的活锥虫样品CPM值差异非常显著（P＜0．01），在保存液中添加3H－TdR的活锥虫样品与死锥虫样品的CPM值差异也非常显著。说明3H-TdR渗入到活锥虫体内，在低温条件下伊氏锥虫仍有代谢活动。