生防菌+恶霉灵最优组合的筛选及对苦瓜枯萎病的防治效果研究

苦瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）侵染引起的一种土传病害，目前市场上缺乏防治效果较好的农药或生防菌剂。为了更好地防治苦瓜枯萎病，通过盆栽试验筛选出绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）G5 与恶霉灵复配施用的最优组合，并在苦瓜枯萎病发病样地对盆栽试验筛选出的最优组合进行防效验证。试验结果表明：菌药组合B+0.75Hym（1×10⁹ cfu · mL^-1 G5 菌悬液+187.5 mg · L-¹ 恶霉灵）处理对盆栽苦瓜枯萎病的防病效果为81.60%，明显高于其他处理；同时该组合对苦瓜幼苗的促生作用最为明显。接种苦瓜枯萎病菌后，菌药组合B+0.75Hym的苦瓜叶片中PAL、PPO、POD 防御酶活性较高。田间防效验证试验中苦瓜苗移栽30、60 d 后菌药组合B+0.75Hym 对苦瓜枯萎病的防治效果较高，分别达到了52.59%、32.13%，且苦瓜产量也高于其他处理。表明盆栽试验筛选出的菌药最优组合B+0.75Hym 不仅能够降低农药的使用量，而且能够有效防治苦瓜枯萎病，提高苦瓜产量，有一定的生产实用价值。     

生防因子螺旋毛壳ND35的细胞壁降解酶与重寄生作用

1　IntroductionSomespeciesofthesaprophyticascomycetegeneraChaetomiumKunzeexFr .arepotentialantagonistsofseveralplantpathogenicfungi ,forexampleRhizoctoniasolaniandPythiumultimumwhichcauseseedlingdamping -offandVenturiainaequaliswhichcausestheapplescabChae…     

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

苦瓜枯萎病生防木霉的筛选鉴定及其定殖的qPCR检测

为绿色防控苦瓜枯萎病,本研究从苦瓜根际土中分离出多株木霉,通过平板对峙培养法和盆栽防病试验进行拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌株筛选,对筛选到的菌株进行形态学及分子生物学鉴定,并运用实时荧光定量PCR技术对其在苦瓜植株及土壤中的定殖能力进行检测。结果表明:筛选得到两株防效较好的木霉菌株M2和MX,对苦瓜枯萎病的防治效果分别达54.63%和45.72%。结合形态学和分子生物学鉴定,确定M2菌株为绿木霉(Trichoderma virens),MX菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。木霉菌株M2和MX均不能在苦瓜植株中定殖,但在土壤中可以稳定定殖。两个木霉菌株具有应用于苦瓜枯萎病的田间生物防治潜力。     

球毛壳菌ND35对干旱胁迫下苦瓜幼苗生理特性的影响

以"长绿箭"苦瓜为试材,利用盆栽控水法,研究了接种球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35对不同水分处理条件下苦瓜幼苗生理特性的影响,以期为球毛壳菌ND35在苦瓜生产中的应用提供参考依据。结果表明:与未接种对照组相比,接种球毛壳菌ND35各处理组的叶片相对含水量提高1.98%~5.19%;叶片脯氨酸含量降低38.48%~58.58%;丙二醛含量降低6.89%~26.10%;可溶性蛋白质含量提高23.65%~27.24%。在中度和重度水分胁迫条件下,接种球毛壳菌ND35较未接种对照组的苦瓜叶片中SOD活性分别提高42.32%和45.72%;POD活性分别提高28.47%和21.73%;CAT活性分别降低69.44%和49.15%。在不同水分处理条件下,接种球毛壳菌ND35显著提高了苦瓜幼苗的相对含水量、可溶性蛋白质含量和抗氧化酶活性,明显降低了脯氨酸含量和丙二醛含量。     

内生菌螺旋毛壳抗生素和水解酶的协同抗真菌作用

 生防因子螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35生长于含立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝细胞壁制备物的SM培养基中,从培养滤液提取的粗酶液强烈抑制Valsa sordida、Valsa mali、Glomerella cingulata和Curvulavia lunata病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。经DNS法检测,粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶(包括内切和外切酶)和几丁质酶活性,分别为0.19 U.mg-1和0.09 U.mg-1。生长于3%玉米粉浸渍液的螺旋毛壳ND35的培养滤液也能抑制上述病原菌的菌丝生长和孢子萌发。离体条件下检测了ND35产生的一纯化的具有分子量为73 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶(GLUC73)和一纯化的抗生素对苹果炭疽病菌的分生孢子萌发和芽管延长的抑制效果。当内切β-1,3-葡聚糖酶使用浓度为180 μg·mL^-1时,抑制了测试真菌的孢子萌发,造成细胞壁的改变,导致了菌丝顶端的破裂;抗生素的有效抑菌中浓度ED₅₀为1.75 μg·mL^-1。单独应用时,1.0 μg·mL^-1的抗生素或40 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶没有或仅有很低的抑菌效果;两者组合导致孢子萌发约78%受抑制。甚至10 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶也使1.5 μg·mL^-1抗生素的抑菌作用从低于25%增加到超过50%的抑菌效果。此外,80 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶使1.0 μg·mL^-1抗生素的抑菌活性从0%提高到90%。抗生素和β-1,3-葡聚糖酶的协同抗菌活性可能在内生菌螺旋毛壳的植病生防中起重要作用。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。     

内生真菌球毛壳ND35的生物安全性评价

本试验初步研究了植物内生真菌球毛壳（Chaetomium globosum）ND35抗生物质粗提物对植物生长性状和植物根际土壤微生物的影响,对小白鼠、大白兔的毒性,子囊孢子在水中的存活及对鱼类的安全性。结果表明,球毛壳ND35抗生物质粗提物对黄瓜、菜豆和小麦的种子是安全的,并且能够显著增加须根数和根鲜重,促进种苗生长,对根际菌群数量无显著影响,对动物来说属低毒级;球毛壳ND35子囊孢子在水中能自行消解,且低于10^5cfu／ml时为泥鳅生长无显著影响;表明球毛壳菌ND35无毒、无污染,用于土传病害的生物防治无明显性风险。     

微生物酶及其在植物病害生物防治中的作用

介绍了生防菌产生的细胞壁降解酶,如几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶及其生防作用机制,不同细胞壁降解酶之间以及与抗生素等次生代谢产物之间的协同抑菌作用,以及细胞壁降解酶在植物病害生防中的潜在应用。